桑枝多糖基于YAP/TAZ 信号通路调控db/db 小鼠肾纤维化作用的研究

余文胜 黄 飞 郑 妮

糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的、严重的微血管并发症，且超过三分之一的糖尿病患者伴发DN，并最终发展为终末期肾脏疾病（ESRD），成为糖尿病致死、致残的主要因素[1]。DN 临床治疗较为棘手，且尚缺乏特异性、针对性的治疗药物，目前主要以血糖控制为基础，联合抗氧化、血管紧张素转化酶抑制剂和钙拮抗剂等药物进行综合治疗，但从临床疗效上看，目前的治疗方案只是减缓肾功能减退及肾纤维化的发展，仍难以阻止其病程进展[2-3]。

桑枝Mori Ramulus 是桑科植物桑Morus alba L.的干燥树枝，具有祛风活络、通利关节、燥湿利水、降血糖降血脂以及提高机体免疫功能等多种药效[4-5]。桑枝多糖为桑枝的主要成分之一，课题组前期研究结果表明，桑枝多糖具有良好降血糖，增强糖尿病小鼠肾脏抗氧化能力，改善氧化应激对肾组织损伤的作用[6]，但其对DN 的作用机制并未完全阐明。本研究以自发型2 型糖尿病db/db 小鼠为DN 模型，探究桑枝多糖对DN 的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 24 周龄db/db 小鼠40 只，db/m 小鼠10 只，SPF 级，雌雄各半，体质量（47.27±1.62）g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2018-0027，实验动物生产许可证：SYXK（苏）2018-0008。小鼠饲养于通风良好的环境，室温18～25℃，相对湿度40～70%，12h 光照昼夜循环。

1.2 药 物 本研究应用的桑枝经广西中医药研究所鉴定。桑枝多糖制备[7]：干燥桑枝1kg，粉碎成粗粉，使用6000mL 80%的乙醇溶液，85℃下回流提取4次，每次2h，过滤，滤液减压至无醇味，加2000mL 双蒸水，煮3 次，每次2h，过滤，合并滤液，10000pr/min离心10min，用微波真空干燥器浓缩，得浓缩液250mL，经氯仿-正丁醇（5∶1）多次萃取后除去蛋白质。提取液4℃过夜，10000pr/min 离心10min，过滤，加入5 倍量95%乙醇，使乙醇终浓度为70%，醇沉24h，抽滤，收集药渣，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤3 次，所得药渣定性测定含粗多糖。将多糖粗品溶于水，加样到经PBS 缓冲液（pH=7.8）处理的树脂层析柱中，静止12h，用双蒸水以2mL/min 流速进行洗脱，合并洗脱液，真空干燥得桑枝多糖。经紫外-可见分光计测定样品中的桑枝多糖纯度达85.6%；缬沙坦，海南皇隆制药股份有限公司，批号191205。

1.3 试 剂 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、纤维连接蛋白（FN）、胶原Ⅰ型（CollagenⅠ）ELISA 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号200720、200811、200705、200716、200818；单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、结缔组织生长因子（CTGF）ELISA 试剂盒，圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司，批号Sc-52734、Sc- 102086；兔抗人Yes 相关蛋白（YAP）、TEAD 多克隆抗体，美国Cell Signaling Technology 公司，批号20271、20397。

1.4 主要仪器 9602A-酶标仪（北京艾普生设备有限公司）；全自动生化分析仪（日立公司，7100）；Gel doc200 低温高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；垂直电泳仪（BIO-RAD 公司）；转膜及显影设备（BIORAD 公司）；罗氏卓越型血糖仪（ACCU-CHEK Performa）。

2 实验方法

2.1 动物分组及给药 自发型2 型糖尿病24 周龄db/db 小鼠40 只，24 周龄db/m 小鼠10 只，均雌雄各半。使用随机数字表法将db/db 小鼠分为模型组、缬沙坦组（20mg/kg）、桑枝多糖低剂量组（600mg/kg）、桑枝多糖高剂量组（1200mg/kg），每组10 只，日常进行高脂饮食喂养，连续灌胃相应药物60 天，每天1 次。db/m 小鼠为空白组，日常进行普通饲料喂养，模型组与空白组小鼠灌胃等体积生理盐水60 天。

2.2 HE 染色方法 将制作好的肾脏蜡块切片，切片厚度4μm，切片用二甲苯脱蜡，置于二甲苯与纯乙醇混合液中，乙醇逐级脱水，苏木精染液染色，水洗及0.5%盐酸乙醇分色，蒸馏流水冲洗，伊红染液染色，乙醇逐级脱水后二甲苯透明，封片。观察小鼠肾组织病理学变化。

2.3 生化指标检测 于第60 天采集小鼠尿液，测量尿量，采用终点法测24h 尿白蛋白（UP）含量；末次给药后，小鼠禁食不禁水12h，使用血糖仪检测小鼠空腹血糖（FBG）；眼眶静脉取血，高速冷冻离心分离血清，使用全自动生化分析仪测定小鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量。

2.4 ELISA 法检测小鼠肾组织纤维化指标 剥离小鼠肾组织，低温条件下将其制成约10%的匀浆液，按ELISA 试剂盒说明书操作，检测小鼠肾组织TGFβ1、FN、CTGF、CollagenⅠ表达及炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1 表达量。

2.5 蛋白免疫印迹法检测小鼠肾组织YAP、TAZ 表达量 剥离小鼠肾组织，低温条件下将其制成约10%的匀浆液，冰浴静置30min，高速冷冻离心机中离心5min，分离上清液，提取肾组织总蛋白。在SDSPAGE 胶上加入Marker 及检测蛋白，转移至PVDF膜后加5%脱脂奶粉，洗膜，加入一抗（1∶500），4℃低温环境下孵育过夜，洗膜，加入稀释的二抗（1∶2000），低温静置孵育60min，洗膜，暗室中曝光显影。电泳成像分析系统扫描、分析蛋白条带。

3 实验结果

3.1 桑枝多糖对db/db 小鼠FBG 的影响 与空白组比较，给药前各组小鼠FBG 均明显上升，给药后，桑枝多糖低、高剂量组小鼠FBG 有所下降，但仍高于空白组（P<0.05）。与模型组给药后比较，缬沙坦组小鼠FBG 无明显改变（P>0.05），桑枝多糖低、高剂量组小鼠给FBG 均明显降低（P 均<0.05）。见表1。

表1 桑枝多糖对db/db 小鼠FBG 的影响（mmol/L，）

表1 桑枝多糖对db/db 小鼠FBG 的影响（mmol/L，）

注：空白组为db/m 小鼠，予生理盐水；模型组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理盐水；缬沙坦组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg 缬沙坦混悬液；桑枝多糖低剂量组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混悬液；桑枝多糖高剂量组为自发型2型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混悬液；FBG 为空腹血糖；与空白组同期比较，aP<0.05；与本组给药前比较，bP<0.05；与模型组给药后比较，cP<0.05

3.2 桑枝多糖对db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影响 与空白组比较，模型组小鼠24h尿量、UP 含量及血清Scr、BUN 含量明显升高（P 均<0.05）。与模型组比较，缬沙坦组及桑枝多糖低、高剂量组小鼠24h 尿量、UP 含量及血清Scr、BUN 含量均明显降低（P 均<0.05）。见表2。

表2 桑枝多糖对db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影响（）

表2 桑枝多糖对db/db 小鼠24h 尿量、UP 及血清Scr、BUN 的影响（）

注：空白组为db/m 小鼠，予生理盐水；模型组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理盐水；缬沙坦组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg缬沙坦混悬液；桑枝多糖低剂量组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混悬液；桑枝多糖高剂量组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混悬液；UP 为尿白蛋白；Scr 为血清肌酐；BUN 为尿素氮；与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

3.3 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织病理学变化 肾脏病理切片结果显示，空白组小鼠肾小球数量多，分布广泛，其结构饱满完整。模型组小鼠肾小球囊腔内皱缩严重，肾小球基底膜均质性增厚且出现大量空泡及细胞核固缩现象，数量较少。缬沙坦及桑枝多糖低、高剂量组小鼠肾小球囊腔皱缩程度减少，仍有空泡出现，肾小球数量较模型组多。见图1。

图1 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织病理学变化（HE 染色×400）

3.4 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织炎症因子、趋化因子的影响 与空白组比较，模型组小鼠肾组织炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1 含量显著升高（P 均<0.05）。与模型组比较，缬沙坦组及桑枝多糖低、高剂量组小鼠肾脏TNF-α、IL-6、MCP-1 含量明显降低（P 均<0.05）。见表3。

表3 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织炎症因子、趋化因子的影响（ng/L，）

表3 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织炎症因子、趋化因子的影响（ng/L，）

注：空白组为db/m 小鼠，予生理盐水；模型组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠，予生理盐水；缬沙坦组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予20mg/kg 缬沙坦混悬液；桑枝多糖低剂量组为自发型2 型糖尿病db/db 小鼠予600mg/kg 桑枝多糖混悬液；桑枝多糖高剂量组为自发型2型糖尿病db/db 小鼠予1200mg/kg 桑枝多糖混悬液；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白介素-6；MCP-1 为单核细胞趋化蛋白-1；与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

3.5 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织纤维指标的影响与空白组比较，模型组小鼠肾组织TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ含量显著升高（P 均<0.05）。与模型组比较，缬沙坦组及桑枝多糖低、高剂量小鼠肾脏TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ含量明显降低（P 均<0.05）。见表4。

表4 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织纤维指标的影响（ng/mL，）

表4 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织纤维指标的影响（ng/mL，）

3.6 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织YAP、TAZ 表达的影响 与空白组比较，模型组小鼠肾组织YAP、TAZ 蛋白表达显著增加（P 均<0.05）。与模型组比较，缬沙坦组及桑枝多糖低、高剂量小鼠肾组织YAP、TAZ 蛋白表达降低（P<0.05）。见表5、图2。

图2 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织YAP、TAZ 表达的影响

表5 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织YAP、TAZ 表达的影响（）

表5 桑枝多糖对db/db 小鼠肾组织YAP、TAZ 表达的影响（）

4 讨论

DN 发病机制复杂，主要由于长期的高血糖影响，造成肾小球血流动力学的改变、引起肾小球高压，肾脏系膜细胞受刺激后增殖、肥大，使基质增生[8]。同时肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的过度活跃和大量活性氧、炎症因子的生成，导致肾小球足细胞损伤、提高肾脏细胞外基质（ECM）的增殖水平，促使肾脏的炎症及纤维化的发生[9]。肾脏纤维化是DN 进入终末期的病理过程，其病程一般分为五期，主要以肾小球滤过率、肾小球毛细血管基底膜的厚度及宽度、蛋白尿、肾小管间质纤维化、肾小球硬化等指标判断病程的发展。

肾小球和肾小管的巨噬细胞炎性浸润及其大量聚集，是糖尿病肾损伤的主要病理特征[10]。在高糖环境下，单核细胞在黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及趋化蛋白MCP-1 的作用下迁移到肾脏微环境，分化为巨噬细胞及进一步活化，释放炎症因子TNF-α、IL-6及纤维化因子TGF-β1 等细胞因子，加重肾组织的炎症反应，诱导肾脏局部慢性亚临床肾炎，促使肾小球系膜细胞对ECM 的分泌增加，进而引起成纤维细胞的增殖，系膜细胞外基质沉淀肾小球硬化及间质纤维化，促进糖尿病肾纤维化的发展[11-12]。

YAP/TAZ 复合物是对进化上有着高度保守的Hippo 信号通路的核心元件，其对器官大小的调控，肾脏成纤维细胞增生，肌成纤维细胞生成、分化、凋亡等重要的生物学过程均发挥着重要的作用。其中YAP 是调节细胞的增殖、分化及介导上皮间质转化的关键因子。肾脏正常状态下，磷酸化的YAP 与14-3-3 调控蛋白结合，调控CTGF、FN、CollagenⅠ等下游靶因子的表达，维持细胞生存平衡[13]。肾脏高糖内环境下，去磷酸化的YAP 会从细胞质向细胞核迁移且活化，与组织TEAD 相互作用，激活重要的纤维因子CTGF，促进细胞增殖和细胞外基质合成，以肾纤维化的方式修复慢性肾脏疾病的肾脏损伤[14]。TAZ 是YAP 的同源蛋白，在DN 的进展中发挥重要作用。研究表明，TAZ 在肾脏足细胞和肾小管上皮细胞的高表达，可激活纤维蛋白CTGF 的表达，进一步加重DN 的肾纤维化[15]。另外，由于YAP 诱导肾小管TGFβ1 表达，进而刺激HK-2 细胞，导致TAZ 蛋白表达增加，引发HK-2 细胞的增殖缺陷，介导细胞增殖和细胞外基质合成及肾纤维化的形成[16]。

实验结果表明，桑枝多糖能有效改善DN 小鼠肾功能及肾组织的病理变化，减低肾脏间质纤维化指标TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ、炎症因子TNFα、IL-6 及趋化蛋白MCP-1 含量，以减缓肾脏间质纤维的形成；同时降低肾组织YAP、TAZ 表达。提示，桑枝多糖可能通过调节肾组织YAP、TAZ 的蛋白表达，及抑制YAP/TAZ 信号通路下游的趋化蛋白MCP-1、纤维化指标TGF-β1、FN、CTGF、CollagenⅠ及炎症因子TNF-α、IL-6 生成，减缓肾脏间质纤维的形成及炎症因子对肾组织的攻击损害，降低细胞外基质合成，达到抗纤维化的作用。