基于网络药理学探讨澳洲茄碱抗肿瘤机制

高聚伟 徐 凯 冉 冉

恶性肿瘤严重危害人类健康，据统计全球每年新发恶性肿瘤1808 万例，死亡956 万例，而中国分别占新发的23.7%和死亡的30%[1]。中医辨治肿瘤经验丰富，是我国肿瘤治疗重要组成部分。中药通过多靶点、多途径、多效应抗肿瘤，在肿瘤防治中应用广泛。澳洲茄碱（solasonine，SS）是传统抗癌中药龙葵（Solanum nigrum L.）的主要抗癌成分，研究表明，澳洲茄碱通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻断细胞周期等机制，在膀胱癌、肝癌、胃癌等多种癌肿中发挥抗肿瘤效应[2-5]。澳洲茄碱抗肿瘤作用靶点及机制目前未完全明确。因此，本研究利用网络药理学方法，对澳洲茄碱抗肿瘤作用靶点及机制进行研究，为澳洲茄碱进一步实验研究和临床使用提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 澳洲茄碱药物靶点筛选 使用TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）获得澳洲茄碱mol2 结构，导入Pharm Mapper 数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），取Norm Fit 预测得分大于0，经uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点名称矫正统一，筛选出澳洲茄碱潜在靶点。

1.2 肿瘤疾病靶点筛选 以“cancer”为关键词，使用OMIM（https://omim.org/）、Genecards 数据库（https://www.genecards.org/）检索，获得疾病作用靶点。

1.3 澳洲茄碱-肿瘤共同靶点筛选及“疾病-靶点-成分”网络构建 在Venny2.1 在线软件作图工具平台（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上输入澳洲茄碱潜在靶点及肿瘤疾病靶点，绘制韦恩图，两者交集即为澳洲茄碱-肿瘤共同靶点。将澳洲茄碱潜在靶点和澳洲茄碱-肿瘤共同靶点输入Cytoscape3.7.2软件中，绘制“疾病-靶点-成分”相互作用网络图。

1.4 澳洲茄碱-肿瘤蛋白相互作用网络构建及基于聚类分析的核心靶点筛选 将澳洲茄碱-肿瘤共同靶点输入STRING 数据库（https://string-db.org/）中检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，将获取的靶点相互作用网络关系数据导入Cytoscape3.7.2 软件，绘制蛋白相互作用网络图（PPI 网络）。将PPI 网络导入Cystoscap3.7.2，使用MCODE 模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选。

1.5 澳洲茄碱-肿瘤基因功能及通路富集分析 基于R3.6.0 软件用Bioconductor 生物信息软件包，以P<0.05、Q<0.05 进行关键靶基因GO 功能与KEGG通路富集分析，对澳洲茄碱-肿瘤共同靶点进行生物学功能及主要信号通路分析，将结果以条形图或气泡图形式输出。

2 结果

2.1 澳洲茄碱潜在抗肿瘤作用靶点信息 共获得289 个澳洲茄碱潜在靶点，1186 个肿瘤靶点，韦恩图中两者取交集后获得79 个澳洲茄碱-肿瘤共同靶点（见图1）。将此79 个共同靶点和澳洲茄碱潜在靶点输入Cytoscape3.7.2 软件中，绘制出“疾病-靶点-成分”相互作用网络图，图中红色代表疾病，紫色代表澳洲茄碱，蓝色代表79 个共同靶点（见图2）。

图1 澳茄碱洲-肿瘤靶点基因匹配情况

图2 澳洲茄碱与肿瘤作用靶点网络

2.2 PPI 分析结果及澳洲茄碱抗肿瘤核心靶点信息PPI 网络见图3，共有79 个节点（靶基因）通过968条边发挥作用。节点的大小、颜色及其深浅变化代表Degree 值的大小。实验结果表明，澳洲茄碱抗肿瘤的各个靶点之间联系紧密。进一步聚类分析筛选得到3个基因簇和3 个核心基因：IGF1R、MAP2K1、CHEK1，见图4。

图3 PPI 关系网络

图4 PPI 核心基因簇

2.3 GO 功能富集分析 将79 个澳洲茄碱-肿瘤共同靶点经R 语言运行后进行GO 分析，包括生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和 分 子 功 能（molecular function，MF）。GO 结果显示，共富集至1559 条生物学过程、33 条细胞组成过程和116 条分子功能过程中。根据P 值，将前10 个条目进行数据可视化处理形成条形图（见图5）。结果表明，澳洲茄碱可能通过参与调控多种与肿瘤发生发展关系密切的生物学过程来发挥抗肿瘤作用。

图5 澳洲茄碱-肿瘤关键靶点的GO 生物学过程富集分析

2.4 KEGG 富集分析 对79 个澳洲茄碱-肿瘤共同靶点经R 语言运行后进行KEGG 通路富集分析，得到136 条KEGG 通路，包括前列腺癌、大肠癌、肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、慢性粒细胞白血病、膀胱癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、胰腺癌等通路，涉及PI3KAkt 信号通路、MAPK 信号通路、Ras 信号通路、ErbB信号通路、VEGF 信号通路、T 细胞受体信号通路等经典信号通路。排名前20 的有蛋白聚糖、前列腺癌、内分泌抵抗、PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、Ras 信号通路、乙型肝炎、雌激素信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、松弛素信号通路、FoxO 信号通路、大肠癌、催乳素信号通路、肝细胞癌、粘附连接、乳腺癌、Rap1 信号通路、胃癌、慢性粒细胞白血病、膀胱癌通路。由此推测，澳洲茄碱可能通过调节以上信号通路来发挥抗肿瘤作用。根据P 值，将排名前20 的结果形成KEGG 功能富集的气泡图（见图6）。通过通路基因参与数、P 值及富集因子分析，前9 通路相关基因靶点见表1。

图6 澳洲茄碱-肿瘤关键靶点的KEGG 代谢通路富集分析

表1 澳洲茄碱-肿瘤关键靶点的KEGG 代谢通路富集靶点

3 讨论

中药的活性化合物是药物最佳来源之一，但人们对其作用靶点和机制了解不深[6]，采用计算方法重新定位受体中的药物分子正成为药物研发主流[7]。中药龙葵对多种肿瘤均有显著抗癌疗效[8]，澳洲茄碱为主要活性成分，但其具体作用靶点及机制并未完全明确。网络药理学作为分析中药作用机制的新兴学科，包含网络构建、网络分析及实验验证，为阐明中药现代药理机制提供了新方法[9]。

本研究依据网络药理学，对澳洲茄碱抗肿瘤潜在作用靶点及通路进行了较系统分析。结果共筛选出79 个抗肿瘤相关靶点，其中3 个核心基因为IGF1R、MAP2K1 和CHEK1。IGF1R 调控细胞生长和分化[10]，刺激细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，与肿瘤发生发展及转移关系密切[11]。MAP2K1 则参与增殖、分化、转录调节和发育等许多细胞过程[12]。CHEK1 介导细胞周期阻滞、应对DNA 损伤，是癌症治疗潜在靶点[13]。在澳洲茄碱抗肿瘤信号通路中，PI3K-Akt、MAPK 及Ras 与肿瘤发病机制关系密切。PI3K-Akt参与调控癌细胞的增殖、存活、转录、翻译和代谢等过程[14]。Ras/MAPK 是胞内传导主要途径，在胚胎生长、细胞分化中发挥重要调控作用。Ras 和PI3K 与细胞增殖紧密相关，通过调控下游mTOR 在调控细胞生长方面发挥关键作用。Ras-PI3K 及其激活的mTOR 信号通路涉及多个癌基因与抑癌基因的激活和失活，是当下肿瘤研究热点[15]。由此可见，澳洲茄碱抗肿瘤的作用靶点及作用机制与上述3 个核心基因和PI3K-Akt、MAPK 及Ras 等信号通路关系密切。

综上所述，澳洲茄碱参与多个生物学过程和信号通路，抗肿瘤核心靶点为IGF1R、MAP2K1 和CHEK1，核心信号通路为PI3K-Akt、MAPK 及Ras，提示澳洲茄碱具“多靶点-多通路”作用机制。