复合酶水解技术改善绿茶浓缩液品质的研究

杨晓丽

（上海康识食品科技有限公司，上海201103）

我国的茶文化源远流长，已经有几千年的历史[1]。茶叶中富含茶多酚、矿物质、氨基酸、维生素、膳食纤维和咖啡碱等，具有降压、减肥、健美、抗辐射、治糖尿病、提神醒脑、利尿、明目等诸多功效，茶饮料又具有低热量、低糖、纯天然和消暑解渴的特点，因而茶饮料已成为人们消费的一种潮流[2]。目前茶饮料在我国是仅次于水、碳酸饮料的第三大饮品，年产值约1500亿元，市场销售潜力巨大[3]。

茶浓缩液是以成品茶为原料，经过浸提、净化、浓缩、灌装和灭酶等工序制成的茶原汁或调味茶汁，在茶饮料生产中可作为原浆或主剂使用，是一种新的茶叶深加工产品[4]。目前，茶叶浸提方法主要有有机溶剂浸提法和水浸提法。有机溶剂浸提法成本较高，技术难度大，而且对产品有污染[5]。水浸提法成本低、技术成熟、操作简易、适用性广，但也存在浸提不充分，浸提率低等问题[6]。此外，目前水提法生产的绿茶浓缩液氨基酸含量相对较低，并且苦涩味较重，再加上加工过程中滋味香气成分的损失，使得目前的绿茶浓缩液产品普遍存在滋味淡薄苦涩、鲜醇甘爽不足的问题，无法满足高端市场的需求[7]。

酶水解具有专一、反应条件温和等优点，目前已经广泛应用于食品、饲料、制药和化学工业等行业中[8]。将酶水解技术应用于茶饮料的加工过程中，不仅能避免物理方法和化学方法导致的成分损失[9]，还可以提高茶饮料的营养价值和感官品质[10]。目前茶饮料加工中应用较普遍的酶有单宁酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等，但将多种酶复合使用的研究还不多见。综上所述，为了解决目前绿茶浓缩液产品中的不足，研究使用破壁酶提高茶叶中有效成分的溶出率，通过蛋白酶水解提高氨基酸含量，再联用单宁酶解决茶浓缩液浑浊问题，从而为改善茶浓缩液品质提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

特 制 龙 井 绿 茶 ： 市 售 ；Celluclast 1.5 L、Pectinex Ultra AFP、Pectinex UF：诺维信（中国）生物 技 术 有 限 公 司 ；Rapidase PRESS、Rapidase ADEX-P、Pectinase AR4、Validase FP500： 帝斯曼（ 中 国 ） 有 限 公 司 ；Pectinase PL、Cellulase A、Cellulase T、Protease A2SD、Protease P6SD、Prote AX、Protease MSD、Sumizyme FP：天野酶制剂商贸（上海）有限公司；单宁酶KT05：龟甲万株式会社；Rohament CL、Rohapect B1L：德国AB酶制剂公司。

1.2 仪器与设备

754PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；85-2型数显恒温磁力搅拌器：上海精风仪器有限公司；R201D型旋转蒸发仪：巩义市予华仪器有限责任公司；A670型全自动折光仪：海能仪器有限公司；S-433D型全自动氨基酸分析仪：赛卡姆科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合酶水解技术制备绿茶浓缩液工艺流程

取特制龙井绿茶15 g放入烧杯中，按茶水比1∶13加入蒸馏水，在95℃条件下浸提15 min；待浸提液冷却至45℃后，同时加入破壁酶和单宁酶，恒温搅拌（300 rpm）15 min，再加入蛋白酶恒温搅拌15 min；之后继续在45℃条件下恒温水浴8 h，抽滤收集酶解液，沸水加热15 min灭酶；最后将酶解液浓缩至白利度Brix=40%，即获得绿茶浓缩液产品。

1.3.2 破壁酶水解条件研究

（1）破壁酶的筛选

按1.3.1所述方法制备绿茶浸提液；待温度降低到45℃后，分别加入11种破壁酶（Celluclast 1.5 L、Pectinex Ultra AFP、Pectinex UF、Rapidase PRESS、Rapidase ADEX -P、Pectinase AR4、Pectinase PL、Cellulase A、Cellulase T、Rohament CL、Rohapect B1L），加酶量为茶叶重量的0.5%；在45℃条件下恒温水浴8 h，抽滤收集酶解液，沸水加热15 min灭酶；待温度降低到25℃后，用折光仪测定酶解液的Brix，并以此为指标评价不同破壁酶的水解效果。

（2）破壁酶的复配

采用3因素3水平正交试验的方法优化破壁酶的复配比例。选用L9（33）正交表设计试验，因素和水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.3 蛋白酶水解条件研究

（1）蛋白酶的筛选

按1.3.1所述方法制备绿茶浸提液；待温度降低到45℃后，分别加入6种蛋白酶（Protease A2SD、Protease P6SD、Prote AX、Protease MSD、Sumizyme FP、Validase FP500）， 加酶量为茶叶重量的1%；在45℃条件下恒温水浴8 h，抽滤收集酶解液，沸水加热15 min灭酶；待温度降低到25℃后测定酶解液氨基酸含量，并以此为指标评价不同蛋白酶的水解效果。

氨基酸含量采用茚三酮比色法测定[11]：取样品4.0 mL加入具塞比色管中，每管各加入0.5 mL茚三酮溶液和0.5 mL磷酸盐缓冲液，充分摇匀，在沸水浴下反应15 min，取出后快速冷却至室温，加水至10 mL刻度线，充分摇匀，静置15 min后在570 nm波长条件下测吸光值，并带入到标准曲线y=269.88x+76.104（R2=0.9944）计算氨基酸含量。

（2）水解时间对蛋白酶水解效果的影响

按1.3.1所述方法制备绿茶浸提液；待温度降低到45℃后，加入筛选所得蛋白酶，加酶量为茶叶重量的1%；在45℃条件下恒温水浴10 h，每小时取样测定酶解液的氨基酸含量，比较水解时间对水解效果的影响。

（3）加酶量对蛋白酶水解效果的影响

按1.3.1所述方法制备绿茶浸提液；待温度降低到45℃后，加入筛选所得蛋白酶，加酶量分别为茶叶重量的0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%；在45℃条件下恒温水浴8 h后取样测定酶解液的氨基酸含量，比较加酶量对水解效果的影响。

（4）单宁酶澄清效果评价

按1.3.1所述方法制备绿茶浸提液；待温度降低到45℃后，加入单宁酶KT05，加酶量为茶叶重量的0.1%；在45℃条件下恒温水浴1 h，抽滤收集酶解液，沸水加热15 min灭酶；酶解液和未经酶解的浸提液均在4℃条件下静置过夜，观察比较澄清程度。

1.3.4 感官评价

将绿茶浓缩液用蒸馏水稀释至Brix=0.3%后，由10名经过充分训练的感官评审人员进行感官评价。感官分析包括香气、鲜味、甜味、苦涩感、回甘、饱满感及整体口感7种指标，5分为非常满意，4分为满意，3分为基本满意，2分为一般，1分为基本不接受，0分为完全不接受。

1.3.5 氨基酸分析

使用全自动氨基酸分析仪对浓缩液中不同氨基酸的含量进行分析，具体方法参照参考文献[12]。

2 结果与分析

2.1 破壁酶水解条件优化结果

2.1.1 破壁酶的选择

由图1可知，使用破壁酶水解处理后，茶汤的Brix均有所升高，这表明破壁酶能促进茶叶中有效物质溶出。茶叶细胞壁主要组分为果胶类物质和纤维素，由于其不溶于水，导致茶叶内的有效物质无法充分释放出来[13]。实验选用的破壁酶包括纤维素酶和果胶酶，都能促使茶叶细胞壁破裂，从而使有效成分更易溶出。通过比较不同破壁酶水解后茶汤的Brix可以发现，Rapidase PRESS、Pectinase PL和Rohapect B1L三种酶的促进效果最佳，因此选择这三种酶进行复配优化。

图1 不同破壁酶对水解效果的影响Fig.1 Effect of different wall-breaking enzymes on hydrolysis

2.1.2 破壁酶复合比例优化

为了确定三种破壁酶最佳复配比例，本研究采用L9（33）正交表设计试验，正交实验结果见表2。

表2 破壁酶复配正交实验结果与数据分析Table 2 Result and data analysis of wall-breaking enzymes complexation orthogonal experiment particle-shape green tea

由正交试验结果可知，三种酶影响茶叶水解效果的顺序为：A＞C＞B，即Pectinase PL＞Rohapect B1L＞Rapidase PRESS。最佳复配比例为：Pectinase PL添加量0.5%，Rapidase PRESS添加量0.1%，Rohapect B1L添加量0.2%。通过验证实验表明，在该条件下茶汤酶解液中Brix可达到3.61%。

2.2 蛋白酶水解条件优化结果

2.2.1 蛋白酶的选择

氨基酸是茶汤的重要组分，一方面氨基酸是茶汤鲜味的重要来源，同时部分氨基酸还与香气有关[14]。因此，氨基酸含量与茶浓缩液品质高度正相关。由于氨基酸在天然茶汤中的含量较低，因此提高茶汤中的氨基酸含量，尤其是鲜甜味氨基酸的含量显得尤为重要。

由图2可知，使用蛋白酶水解处理后，茶汤中的氨基酸含量均有所升高，这是由于蛋白酶可以促进茶汤和茶叶中蛋白质的分解所致。通过比较不同蛋白酶水解后茶汤的氨基酸含量可以发现，Sumizyme FP酶的水解效果最佳，因此研究选择该酶进行茶浓缩液的制备。

图2 不同蛋白酶对水解效果的影响Fig.2 Effect of different protease on hydrolysis

2.2.2 蛋白酶水解时间的选择

由图3可知，随着水解时间的增加，茶汤中氨基酸含量在前6 h有较快的升高，但当水解达到8 h之后，氨基酸含量上升趋势明显变缓。因此为了兼顾效率和成本，研究选择蛋白酶水解时间为8 h。

图3 水解时间对蛋白酶水解效果的影响Fig.3 Effect of time on hydrolysis

2.2.3 蛋白酶添加量的选择

由图4可知，随着蛋白酶添加量的增加，茶汤中氨基酸含量呈现先上升后趋于平缓的变化趋势，这表明当加酶量超过1.5%之后，增加加酶量对提升氨基酸含量的效果变得较为微弱。因此，研究选择蛋白酶添加量为1.5%。

图4 加酶量对蛋白酶水解效果的影响Fig.4 Effect of adding amount on hydrolysis

2.3 单宁酶澄清效果

澄清度是影响茶饮料品质的重要因素之一，但茶汤在储藏过程中，尤其是在低温条件下，容易生产乳酪状的浑浊物。这种茶乳酪是由茶汤中的茶多酚、咖啡碱、蛋白质、少量多糖以及疏水性脂质、叶绿素、金属离子等物质间相互作用而形成浑浊沉淀的复杂过程[15-16]，茶饮料的浑浊和沉淀问题是目前茶饮料开发和生产过程中普遍面临的重要技术障碍[17]。酶法处理是一种去除茶乳酪的较好方法，尤其以单宁酶效果最佳，它不仅能很好地消除茶乳酪的形成，而且还能改善茶汤的滋味[18]。

研究按照茶叶重量的0.1%添加单宁酶KT05，用以改善茶汤澄清程度。由图5可以清楚观察到，未添加单宁酶的茶汤在4℃条件下静置过夜后会产生大量浑浊物，而添加了单宁酶的茶汤则仍然保持澄清透明，这表明按本研究的方法添加单宁酶能有效保障绿茶浓缩液的澄清度。

图5 添加单宁酶茶汤澄清程度Fig.5 Clarification degree of tea soup with tanninase

2.4 绿茶浓缩液氨基酸分析

图6为传统水提法与复合酶水解法制备的绿茶浓缩液中各种氨基酸含量对比。由图可知，复合酶水解法制备的绿茶浓缩液中，氨基酸总量比传统水提法制备的绿茶浓缩液增加了145%。这是由于水解过程中蛋白酶能将蛋白质分解为氨基酸，从而导致复合酶水解制备的绿茶浓缩液中氨基酸含量有显著增加。

图6 传统水提法绿茶浓缩液与复合酶水解法绿茶浓缩液氨基酸对比Fig.6 Amino acid comparison between traditional water extraction green tea concentrate and compound enzyme hydrolysis green tea concentrate

天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）和精氨酸（Arg）在茶汤中都具有鲜甜的呈味特点[5]，复合酶水解法制备的绿茶浓缩液中这类氨基酸仍然是氨基酸组分中的主体，并且总量比传统水提法提高了58%。另外，人体必需氨基酸苏氨酸（Thr）、蛋氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）的总量也比传统水提法增加了299%。茶氨酸（The）是茶叶中的主要游离氨基酸，但通过酶水解后茶氨酸含量仅略微升高，说明该酶水解法并不能明显提高绿茶浓缩液中茶氨酸的含量。

2.5 绿茶浓缩液感官评价

研究从香气、鲜味、甜味、苦涩感、回甘、饱满感及整体口感7个方面对传统水提法与复合酶水解法制备的绿茶浓缩液进行了感官评价，结果如图7所示。由图可知，复合酶水解法对绿茶浓缩液感官品质有明显改善作用，尤其在鲜味方面有明显提高，这是因为在酶解过程中生产了大量鲜味氨基酸。此外，复合酶水解还能有效降低绿茶浓缩液的苦涩感，这是由于在酶解过程中茶多酚等苦涩味成分发生转化所致。

图7 传统水提法绿茶浓缩液与复合酶水解法绿茶浓缩液感官评价Fig.7 Sensory evaluation of traditional water extraction green tea concentrate and compound enzyme hydrolysis green tea concentrate

3 讨论

文章以特制龙井绿茶为原料，使用破壁酶、蛋白酶和单宁酶复合水解技术改善绿茶浓缩液的品质与风味，采用正交实验优化了破壁酶的复配比例，采用单因素实验的方法优化了蛋白酶的水解时间和加酶量，并验证了单宁酶对茶汤的澄清效果。结果表明，破壁酶最佳复配比例为Pectinase PL添加量0.5%、Rapidase PRESS添加量0.1%、Rohapect B1L添加量0.2%；蛋白酶Sumizyme FP的最佳水解时间为8 h，最佳加酶量为1.5%；按0.1%加酶量添加单宁酶，可有效改善茶汤澄清程度。采用复合酶水解技术制备的绿茶浓缩液氨基酸含量显著提高，营养成分更加丰富，鲜味和甜味更加明显，苦涩感降低，风味得到明显改善。