进展性缺血性脑卒中病人外周血miRNA的表达水平及临床意义

罗 婷，邵祥忠，谢海洋，秦延昆，曹 建，何 辉

进展性缺血性脑卒中(progressive ischemicstroke，PIS)通常是指缺血性脑卒中病人在48 h内神经功能缺失呈阶梯状加重，若不及时治疗会严重影响病人中枢神经功能及预后效果[1]。PIS病人局部脑组织长时间持续缺血会导致脑细胞坏死，临床非常重视对脑卒中病人的早期治疗[2]。因此，如何准确评估PIS病人病情对后续治疗具有指导作用。相关研究发现，微小核糖核酸(micro RNA，miRNA)与PIS的发生发展关系密切，可以在体液中被检测到，有可能成为PIS病人诊断的标志物[3]。既往研究指出，miR-30a、miR-409可能与细胞自噬调节相关，miR-122、miR-126、miR-221与细胞缺血再灌注相关，这些均与PIS病因有一定的关系[4-5]。本研究观察PIS病人外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221、miR-409的表达水平变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年3月—2019年3月南通大学附属海安医院收治的84例PIS病人作为PIS组，其中男54例，女30例，年龄44～73(56.20±6.31)岁。PIS组纳入标准：符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南[6]对PIS的定义，经影像学诊断确诊为PIS病人。PIS组排除标准：①入院24 h内抢救无效死亡；②合并血液系统疾病；③合并多脏器功能不全；④合并恶性肿瘤；⑤合并血栓性疾病；⑥精神疾病病人；⑦在住院过程中合并肺部感染。选取同期体检健康者90名作为健康组，男55名，女35名，年龄45～75(55.96±6.27)岁。健康组纳入标准：①体检结果均正常；②体检资料完整。健康组排除标准：①既往有脑卒中病史；②合并心、肝、肾等重要器官疾患；③有肿瘤家族史。两组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

治疗14 d后，PIS组病人进行改良Rankin量表(Modified Rankin Scale，mRS)[7]评分，量表共6分，0～2分提示预后良好，3～6分提示预后不良，根据评分结果分为预后良好组(MRS评分0～2分)和预后不良组(MRS≥3分)。预后良好组67例，男42例，女25例；年龄44～72(56.21±6.13)岁；入院数字减影血管造影技术(digital subtraction angiography，DSA)检查：颅内无动脉狭窄27例，单纯颅内动脉狭窄21例，单纯颅外动脉狭窄7例，颅内外动脉狭窄12例；入院格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale，GCS)评分为(8.57±1.13)分。预后不良组17例，男12例，女5例；年龄46～73(56.17±6.22)岁；入院DSA检查：颅内无动脉狭窄2例，单纯颅内动脉狭窄7例，单纯颅外动脉狭窄3例，颅内外动脉狭窄5例；GCS评分(8.63±1.21)分。两组性别、年龄、DSA检查结果、入院GCS评分等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 基本资料收集 回顾性分析所有病人的基本资料，包括性别、年龄、服药情况。在病人治疗14 d后，对其预后情况进行MRS测评。

1.3 实验室检查 收集全部研究对象入院时的外周血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上层血浆移至1.5 mL离心管中，-80 ℃冰箱保存。血浆总核糖核苷酸(ribonucleic acid，RNA)的提取：标本解冻后进行两相分离，通常RNA分布于上层无色水相中；取上层液进行RNA沉淀，管底出现白色沉淀，将获得的白色沉淀进行洗涤和溶解，DU800型分光光度计测定RNA的浓度及纯度；随即进行逆转录反应，将获得的逆转录产物保存于-20 ℃的冰箱中。实时定量荧光聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，Real-time qPCR)技术检测miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221、miR-409水平，Real-time qPCR引物合成由英潍捷基(上海)贸易有限公司提供，聚合酶链反应(PCR)引物序列miR-30a、miR-122 miR-126、miR-221、miR-409分别为：5′-ATGGTTCGTGGGTGTAAACATCCTCG-3′；5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′；5′-GCAGCTACATTGTCTGCT-3′；5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。内参照基因为U6 RNA。严格按照Access RT-PCR System试剂盒说明书进行操作。由SDS软件计算每个样品和内参的Ct值，△Ct=Ct目标基因-Ct内参基因，受试者miRNA的相对表达水平计算公式2-△△Ct。

2 结 果

2.1 PIS组和健康组miRNA表达比较 PIS组外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表达水平均高于健康组，外周血miR-409表达水平低于健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 预后良好组与预后不良组入院时miRNA表达比较 预后不良组外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表达水平均高于预后良好组，外周血miR-409表达水平低于预后良好组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

2.3 外周血miRNA表达水平对PIS预后的预测价值分析 ROC曲线分析显示miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409的曲线下面积(AUC)分别为0.736、0.773、0.868、0.901，选取最佳截断值分别为30.723、1.978、1.720、0.640，提示miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409对PIS病人预后有一定的预测价值。详见表3、图1。

表3 外周血miRNA表达水平对PIS预后的预测价值分析

图1 外周血miRNA表达水平预测PIS病人预后的ROC曲线

3 讨 论

据统计，随着社会老龄化进程加快，脑卒中成为影响人们生活质量的隐形杀手，我国每年新增脑卒中病人约200万例[8-9]。在脑梗死发生后一段时间，神经功能缺损症进一步加重，称为PIS，发病率占脑卒中病人的20%～40%[10]。既往研究指出，感染、血压和发热等都是PIS的独立危险因素，临床上常通过病人临床表现和影像学诊断来判断病人预后情况，缺乏可靠的生物学指标[11-12]。miRNA是一类非编码单链小分子，参与多种疾病过程，同时调控细胞分化、免疫应答等多种过程，存在于易提取的外周血循环系统中，对于疾病的无创诊断、评估病人预后具有重要临床意义[13-14]。因此，本研究探讨PIS病人外周血中5种miRNA的表达水平及其临床价值。

miRNA-30a是miR30家族中一员，通过靶向调节线粒体分裂来促使细胞凋亡，在细胞自噬的过程中发挥作用[15]。既往研究指出，miRNA-30a在缺血性脑卒中小鼠的大脑中表达上调，对于肿瘤细胞和心肌细胞的自噬活性都有所影响，但对于PIS的研究较少[16-17]。本研究发现，miRNA-30a在PIS病人的外周血中表达上调，且预后不良组miRNA-30a表达高于预后良好组(P<0.05)，对病人预后有一定的预测价值。近年来，关于miR-122在肿瘤组织中的表达情况研究较多，提示miR-122的高表达可作为癌症早期诊断的重要指标[18]。罗斌等[19]通过建立脑缺血再灌注损伤小鼠模型，发现miR-122可能通过抑制胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的表达，加重脑部损伤。本研究中miR-122在PIS病人外周血中表达上调，且上调程度与预后情况相关，预后不良组miR-409水平低于预后良好组，推测miR-122的高表达和miR-409下调可能是PIS的潜在诱因，在PIS的诊断和预后判断中都有一定的价值。俞岭芳等[20]观察急性缺血性脑卒中病人外周血miR-409、miR-122表达，发现miR-122在病人体内上调，miR-409出现下调，与本研究结果类似。miR-126具有抑制血管细胞黏附因子-1的作用，而且对血管内皮生长因子的信号传导有影响，而多项研究表明，miR-126表达水平和脑梗死严重程度呈正相关[21-22]。本研究中miR-126在PIS病人的外周血中表达上调，预后不良组miR-126表达高于预后良好组(P<0.05)，推测可能预后不良病人缺血再灌注损伤加重，应尽早预防。王芳等[23-24]研究显示，miR-221在下肢缺血性疾病和脑胶质瘤病人中异常表达，血清中miR-10b、miR-21和miR-221联合检测可作为脑胶质瘤的早期诊断依据。本研究中miR-221在PIS病人中呈高表达(P<0.05)，但对病人预后情况无预测价值。

本研究分析miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409对PIS病人预后的预测价值，4种miRNA均有中等水平的预测价值，其中miR-409的诊断价值最高，AUC达0.901，其敏感度和特异度分别为82.4%、85.1%。本研究选取病例较少，只监测了PIS病人入院时外周血中5种miRNA表达，有待扩大样本量进一步分析治疗过程中多种miRNA的动态变化，尝试多种miRNA联合诊断，为PIS病人提供更准确的临床评估。

综上所述，PIS病人外周血miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表达高于健康者，miR-409表达低于健康者，且预后不良PIS病人miR-30a、miR-122、miR-126、miR-221表达更高，miR-409表达更低，miR-30a、miR-122、miR-126、miR-409对PIS病人的早期诊断和预后评估都有一定的价值，而miR-221对PIS病人预后的预测价值暂未明确。