长期高盐所致高血压大鼠主动脉eNOS蛋白表达及主动脉血管平滑肌细胞BKCa电流的变化

王艳炜，李 霞，耿 彬，张铁军，苗华为

高血压发病机制复杂，病因多样，其中基因与环境为主要致病因素，而高盐摄入是引起高血压的一个重要环境因素[1]。长期处于高盐环境可造成内皮功能障碍、一氧化氮(NO)的合成减少，而NO是机体抗高血压的重要保护因子。内皮细胞是合成NO的主要场所，一氧化氮合酶(nitric oxide synthetase，NOS)是唯一限速酶，内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)在催化NO产生方面具有重要作用[2-3]，但关于其在高盐所致的高血压中报道较少。研究显示，NO在原发性高血压的发生、发展中具有重要作用，具有降压、抑制平滑肌细胞增殖的作用[4]。而平滑肌细胞在高盐所致高血压中的作用尚不明确，激活钾通道广泛分布于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)上，与平滑肌细胞功能关系密切，但关于电导钙激活钾通道电流变化的报道较少，大电导钙离子激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)是电导最大的钙激活钾通道[5-6]。因此，观察BKCa电流变化可反映血管平滑肌细胞在高盐所致高血压中的作用。本研究通过构建动物模型，探讨长期高盐所致高血压大鼠主动脉eNOS蛋白表达及主动脉血管平滑肌细胞BKCa电流的变化。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级3周龄Wistar雄性大鼠60只，体重50～70 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。将60只大鼠随机分为模型组和对照组，每组30只，对照组予以含0.5%NaCl的啮齿类饲料喂养，模型组予以含5%NaCl的啮齿类饲料喂养。饲养环境：温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，饮用水为自来水。分别于0周、4周、8周、12周、16周，采用动脉测压仪测量大鼠处于安静状态鼠尾动脉压，测量时间为08：00～14：00，每次测量6个数值的平均值为当天收缩压。16周后模型组收缩压≥115 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，且比同时点对照组收缩压均值≥20 mmHg，则判定为造模成功。本试验中，模型组12周后收缩压为(138.24±5.33)mmHg，对照组收缩压为(108.12±4.18)mmHg，模型组高于对照组收缩压均值20 mmHg以上，确认造模成功。

1.2 主要实验仪器 动物恒温系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，无创血压测量仪(BP-600A 型，成都泰盟科技)，倒置显微镜系统(XDS-1，重庆光电仪器有限公司)，膜片钳放大器(Axo-patch 200B 型)，pCLAMP 9.0 软件程序和DigiData 1200B 型数/模转换器(Axon 公司，美国)，微电极拉制仪(PC-10型，玉研仪器公司)，电泳仪(DYCZ-24KS型，北京六一仪器厂)，凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)。兔抗鼠微管蛋白β-tubulin抗体，兔抗鼠eNOS抗体、羊抗兔IgG抗体(辣根过氧化物酶标记)、β-tubulin内参均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、蛋白裂解缓冲液、硝酸纤维素膜(PVDF)及其余试剂均购自上海生物工程技术公司。

1.3 大鼠尾动脉无创性血压测量 开启无创血压测量仪，开启前预热20 min左右，压力信号定标后将清醒大鼠装入固定盒内固定，然后放入固定架，固定完成后将加压套插入大鼠尾根部，使鼠尾穿过脉搏传感器插入尾部加热管内，并刚好处于“脉搏信号传感片”上方，调节脉搏传感器，使传感片紧贴鼠尾下方的尾动脉，大鼠脉搏稳定后，测量血压。

1.4 主动脉eNOS蛋白表达水平的测定

1.4.1 主动脉采集 喂养16周结束后，大鼠禁食10 h，用3%戊巴比妥钠0.15 mL/100 g麻醉大鼠，开胸取出胸主动脉，以4 ℃ PBS冲洗，剪去血管外脂肪组织、结缔组织，滤纸吸干后置入液氮冷凝，置于-70 ℃保存待检。

1.4.2 蛋白质印迹法(Western Blot)检测主动脉eNOS蛋白的表达水平 取大鼠主动脉组织，加入蛋白裂解缓冲液，充分研磨组织，取上清液，制备成蛋白样品后，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)进行分离，将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶的PBS中封闭1 h，加入一抗(兔抗鼠微管蛋白β-tubulin抗体1∶1 000稀释，兔抗鼠eNOS抗体1∶800稀释)4 ℃孵育过夜，PBS漂洗，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1∶5 000稀释)，孵育后，ECL法显影。电泳条采用凝胶成像系统进行积分光密度值分析，以β-tubulin作为内参矫正，以每次电泳对照组第一个样品蛋白条带的积分光密度值为1，蛋白质表达的相对水平为其余样品蛋白条与其的比值。

1.5 主动脉血管平滑肌细胞BKCa电流记录

1.5.1 实验溶液配制 酶液Ⅰ：木瓜蛋白酶(1.75 g/L)、二硫苏糖醇(1.75 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)。酶液Ⅱ：胶原酶Ⅰ(2.5 g/L)、透明质酸酶(2.5 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)。溶液Ⅰ：NaCl(127 mmol/L)、MgCl2(1.2 mmol/L)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、葡萄糖(12 mmol/L)、KCl(5.9 mmol/L)、 CaCl2(2.4 mmol/L)，NaOH调pH值至 7.4。溶液Ⅱ：溶液Ⅰ中不加入CaCl2制成。细胞外液：NaCl(150 mmol/L)、CaCl2(1.5 mmol/L)、MgCl2(1 mmol/L)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、KCl(6 mmol/L)、葡萄糖(10 mmol/L)，NaOH 调 pH 值至 7.4。电极内液：Na2ATP(4mmol/L)、EGTA(0.1mmol/L)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(10 mmol/L)、KCl(40 mmol/L)、K2ASP(100 mmol/L)、MgCl2(1 mmol/L)，KOH 调 pH 值至 7.2。

1.5.2 主动脉平滑肌细胞采集 两组分别于0周、4周、8周、12周、16周各取大鼠6只麻醉处死后，取主动脉标本，游离出血管中膜，剪开为长2～4 mm、宽2 mm 的条块，分别加入木瓜蛋白酶(1.75 g/L)、二硫苏糖醇(1.75 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)的酶液Ⅰ和胶原酶Ⅰ(2.5 g/L)、透明质酸酶(2.5 g/L)、白蛋白(2.5 g/L)的酶液Ⅱ，使用急性酶分离法获取单个主动脉平滑肌细胞。

1.5.3 膜片钳记录全细胞 BKCa电流 从分离出的血管平滑肌细胞中选取条理清晰、梭性血管平滑肌细胞置于溶液Ⅱ中，细胞悬液加于灌流槽中，细胞贴壁后，采用1～2 mL/min 的电极外液灌流15～20 min，采用微电机拉制仪拉制电极，选取电极经拉制抛光后电极电阻为4～7 MΩ的拉制电极，微电极使用前充灌内液，持续均匀负压破膜，封接电阻>1 GΩ，完全连通细胞外液和电极内液，形成全细胞模式，pCLAMP 9.0 软件对单个全细胞记录数据和图形进行转换，绘制电流密度-电压曲线，并记录膜电容，计算电流密度(电流强度/膜电容)。电压钳模式设置钳制电位-60 mV，滤波 5 kHz，除极化至-65 mV，记录细胞膜电容(Cm)。使用放大镜进行信号采集，刺激频率 2 Hz，采集频率5 kHz，钳制电位维持于-60 mV，予以去极化方波刺激，频率0.2 Hz，维持时间 400 ms，从 HP -50 mV 逐步去极化至70 mV，继发外向假电流，电流稳定后，记录电流强度。

2 结 果

2.1 两组大鼠收缩压变化比较 重复测量方差分析结果显示，时点效应可以明显影响大鼠收缩压的变化(P<0.01)，且盐分摄入可以明显影响大鼠收缩压(P<0.01)；时点和盐分摄入之间存在着明显交互效应(P<0.01)，提示大鼠收缩压随着时点的变化趋势会因为盐分摄入的不同而不同。进一步两两比较发现，两组大鼠8周时收缩压开始升高，且模型组大鼠8周、12周、16周收缩压较同时点对照组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图1。

单位：mmHg

图1 高盐饮食对大鼠血压影响的趋势图

2.2 两组大鼠主动脉eNOS蛋白表达水平比较 模型组eNOS蛋白表达水平为0.62±0.13，明显低于对照组的1.18±0.18，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2、图3。

图2 两组大鼠主动脉组织eNOS蛋白表达条带图

与对照组比较，＊P<0.05。

2.3 两组大鼠主动脉平滑肌细胞BKCa电流密度变化比较 重复测量方差分析结果显示，时点效应可以明显影响BKCa电流密度的变化(P<0.01)，且盐分摄入可以明显影响BKCa电流密度(P<0.01)，时点和盐分摄入之间存在着明显交互效应(P<0.01)，提示BKCa电流密度随着时点的变化趋势会因为盐分摄入的不同而不同。进一步两两比较发现，两组大鼠8周时BKCa电流密度开始升高，且模型组大鼠8周、12周、16周BKCa电流密度较同时期对照组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图4。

单位：pA/pF

图4 高盐饮食对大鼠主动脉平滑肌细胞BKCa电流密度影响的趋势图

2.4 16周时eNOS蛋白表达、收缩压、BKCa电流密度相关性分析 Pearson相关性分析显示，eNOS蛋白表达与收缩压、BKCa电流密度呈负相关(r=-0.755，P<0.05；r=-0.863，P<0.05)，电流密度与收缩压呈正相关(r=0.972，P<0.05)。详见图5～图7。

图5 eNOS蛋白表达与收缩压的相关性

图6 eNOS蛋白表达与电流密度的相关性

图7 BKCa电流密度与收缩压的相关性

3 讨 论

在我国高血压患病率较高，约为20%，而在全世界范围内患病率可达30%，已成为威胁人类健康的重要疾病，因此，控制高血压是改善社会公共卫生问题，防治心血管疾病的关键[7]。有研究显示，高血压病人中50%～60%为盐敏感者，较血压正常者高出20%～30%[8]。目前认为盐敏感性高血压由遗传、内皮功能障碍、RAAS等多种机制共同作用的结果[9]。本研究以含5%NaCl的高盐饲料和含0.5% NaCl的常规饲料喂养大鼠16周，结果发现，两组大鼠8周时收缩压开始升高，且高盐喂养的模型组大鼠自第8周起收缩压较同时期对照组升高明显，结果与文献[10]报道结果一致。

一般说来，血管舒张和血管收缩功能平衡是维持机体血压正常的关键，当这种平衡遭到破坏时则会发生高血压或低血压，如当血管舒张功能降低时，发生高血压风险明显增高[11]。NO具有舒缓平滑肌的作用，在高血压发生、发展中具有重要的调节作用[12]。一氧化氮合酶包括脑型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶以及eNOS。目前eNOS活性变化是反映血管内皮功能的公认指标。本研究中模型组eNOS蛋白表达水平明显低于对照组，说明eNOS蛋白低表达，可能为盐敏感高血压的诱导因素之一。动物模型研究发现，高盐所致高血压大鼠eNOS蛋白及其mRNA表达水平降低，可能参与了降压机制[13]。因此，模型组eNOS蛋白低表达的可能原因为大鼠长期摄入高盐后，RAAS机制激活，肠系膜动脉组织醛固酮合酶基因高表达，血管内皮组织长期处于高醛固酮环境，内皮组织发生损伤，由内皮细胞生成的eNOS释放量降低，NO合成量下降，平滑肌舒缓不足，收缩功能占上风，平衡遭到破坏，血压升高[14-15]。

血管平滑肌细胞可通过调节血管收缩功能而影响血压[16]。有学者认为，高盐饮食可导致细胞内Na+水平升高，而 Na+和Ca2+可通过细胞膜交换体进行交换，使细胞内Ca2+含量升高，从而引起血管平滑肌收缩、血压升高[17-18]。BKCa通道在各种平滑肌细胞中普遍存在，可调节膜电压和钙离子内流，限制去极化和抵抗血管收缩[19]。当细胞内钙浓度升高时，BKCa通道被持续激活，导致超极化，并作为超极化因素抑制电压依赖钙通道的开放，减少钙离子内流，以此使血管扩张，对抗血管收缩。既往研究表明，BKCa是电压依赖性钙敏感钾通道，对维持静息状态下血管张力具有重要作用[20]。本研究中两组大鼠8周时BKCa电流密度开始升高，且模型组大鼠8周、12周、16周BKCa电流密度较同时期对照组明显升高，说明BKCa电流密度随着高盐喂养时间的延长而增大，随着血压的升高而增加。究其原因是高盐可导致血管平滑肌细胞内Ca2+浓度升高，刺激BKCa通道开放，有研究认为，BKCa通道在盐敏感高血压模型中为反馈性调节因素，血压升高可刺激其大量开放[17，21-22]。此外，本研究中Pearson相关性分析显示，eNOS蛋白表达与收缩压、BKCa电流密度呈负相关，BKCa电流密度与收缩压呈正相关。而目前关于高血压血管平滑肌 BKCa电流密度的研究也大多认为BKCa电流密度增加是机体为对抗血压升高而产生的保护性机制[23-24]。

综上所述，长期高盐所致高血压大鼠主动脉eNOS蛋白低表达，主动脉血管平滑肌细胞BKCa电流密度增大，且主动脉eNOS蛋白低表达可能为导致主动脉血管平滑肌细胞BKCa电流密度增大重要原因。本研究不足在于研究中心较为单一，而BKCa电流变化受多种因素影响，仍有待进一步研究。