基于网络药理学探析补中益气汤治疗压力性尿失禁的机制

郑娱 翟新宇 王琛

摘要 目的：探讨补中益气汤治疗压力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）的分子作用机制。方法：运用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索出补中益气汤的药物有效活性成分及其作用靶点。利用GeneGards、OMIM疾病数据库筛选出该病靶点，借助Cytoscape3.7.2软件构建出补中益气汤中药的活性成分-靶点网络和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，采用R软件对靶基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路的分析。结果：共得到补中益气汤有效活性成分182个，通过116个潜在靶标作用于SUI，富集得到GO中2 115个生物过程条目和144条KEGG通路。结论：补中益气汤主要通过槲皮素、山萘酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、7-O-甲基异丁香酚、利可考酮、β-谷固醇、福莫宁、美迪紫檀素、柚皮苷、糖醇等活性成分调节SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1关键靶点，调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、膀胱癌信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路、前列腺癌信号通路、胰腺癌信号通路、乙型肝炎信号通路等多条通路来治疗SUI。

关键词 网络药理学;补中益气汤;压力性尿失禁;机制

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of stress urinary incontinence（SUI）.Methods：Effective active ingredients and action targets of Buzhong Yiqi Decoction were retrieved with the aid of TCMSP while the disease targets were screened out using GeneGards and OMIM databases.The active ingredient of Buzhong Yiqi Decoction-target network and PPI network were established using Cytoscape 3.7.2 software.And then using R software the gene function of the target gene（Gene Ontology，GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway analysis were annotated.Results：A total of 182 effective active ingredients of Buzhong Yiqi Decoction were obtained，and 116 potential targets can act on SUI.GO functional enrichment analysis obtained 2 115 GO itemsin total.KEGG pathway enrichment analysis obtained 20 pathways.Conclusion：Buzhong Yiqi Decoction mainly through quercetin，kaempferol，7-methoxy-2-methyl isoflavone，7-O-methyl isoeugenol，riccocodone，β-sitosterol，formonine，medicinal pterostilbene，naringin，sugar alcohol and other active ingredients regulates key targets of SELE，ICAM1，MMP3，MAPK14，CD40LG，PLAU，CCNA2，ERBB3，CASP1，and regulates AGE-RAGE in diabetic complications Signal pathways，bladder cancer signaling pathways，fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathways，TNF signaling pathways，prostate cancer signaling pathways，pancreatic cancer signaling pathways，hepatitis B signaling pathways and other pathways so that SUI can be treated.

Keywords Network pharmacology; Buzhong Yiqi Decoction; Stress urinary incontinence; Mechanism

中图分类号：R694+.54;R271.9;R285;TN711.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.007

女性尿失禁是目前全球最为常见的健康问题之一，随着人口的老龄化和人们生活水平的提高，女性出现尿失禁的状况越来越受到各方重视。近年流行病学的调查结果表示，成年女性的尿失禁发病率在18.5%～57.5%，而且随年龄的增长而上升[1]。在所有类型的尿失禁当中，压力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）是最为常见的。国际尿控协会（International Continence Society，ICS）将SUI定义为：当腹部压力突然增加，例如运动，打喷嚏或咳嗽时，患者会出现不自主的尿液溢出[2]。SUI常见于年老体弱、妊娠分娩损伤、绝经、肥胖等女性患者。国内尿失禁发病率约30%，而其中SUI约占尿失禁总数的42.6%[3]。中国女性的压力性尿失禁发病率达18.9%，其中老年女性的发病率约为30%[4]。目前的治疗方案以行为矫正和保守治疗为主。中医将压力性尿失禁归属类于“遗溺”“遗尿”或“淋证”的范畴，中药治疗压力性尿失禁多从脾肾二脏论治，脾肾气虚，固摄无力。补中益气汤出自《脾胃论》，该方由白术、黄芪、当归、陈皮、甘草、柴胡、人参、升麻组成，主要功效为补中益气、升阳举陷。肖春风等[5]用补脾气温肾阳为治法，针对中气亏虚、肾阳不足型尿失禁。观察组给予补中益气汤为底加上健脾温中、温肾固精之药，结论总有效率达87.68%。张爱华[6]则认为SUI多因脾肾气虚、膀胱失约导致，临床运用補中益气丸联合知柏地黄丸治疗，总有效率达到93.94%。邵朝弟教授提出了补中益气汤不仅能补益中气，还具有补益肺气的功效，对于腹压过高而导致的尿失禁疗效显著[7]。本研究采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库筛选出补中益气汤中8味药的化学活性成分及相应靶点，而后与GeneGards、OMIM数据库中与SUI对应靶点相交，作蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析并筛选核心蛋白，进行GO和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。最终以阐明补中益气汤治疗SUI的分子药理机制，为补中益气汤的临床应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 筛选补中益气汤中药活性成分，估测潜在作用靶点 借助TCMSP数据库搜索出补中益气汤8味药的活性成分，以口服生物利用度（OB）和类药性（DL）作为筛选条件，定OB>30%、DL>0.18为筛选标准，由此可得到符合条件的活性成分靶点信息，而后通过Uniport数据库使得基因名标准化[8-9]。

1.2 预测压力性尿失禁疾病靶点 在GeneCards数据库和OMIM数据库中以“Stress Urinary Incontinence”为关键词检索出与压力性尿失禁相关的基因。

1.3 构建中药-活性成分-靶点基因网络图 运用Cytoscape软件构建疾病-活性成分-关键靶基因网络图[10]。网络中的节点（Node）代表疾病、活性成分和关键靶基因;网络中的边（Edge）用于连接疾病和活性成分、活性成分和关键靶基因。连接到网络的节点以度值（Degree）为单位表示[11]，一个节点连接到其他节点的边越多，其重要性就越大，节点在网络中所起的作用及程度值越大，通过Cytoscape软件构建出中药-活性成分-关键靶基因网络图。

1.4 构建PPI网络，筛选核心靶点 将中药活性成分潜在作用靶点与疾病预测相关靶点取交集，导入至STRING数据库，物种选择为“Homosapiens”，以置信度>0.4为筛选条件，可以得到交集靶点的PPI网络信息，通过degree、closeness、betweenness等条件筛选出前10个关键基因（HubGene），利用Cytoscape软件将其可视化[12]。

1.5 富集分析靶点基因 将补中益气汤作用于SUI的所有靶点导入DAVID数据库，进行GO分析和KEGG通路富集分析，用R包（ggplot2）绘图将其可视化。

1.6 构建基因-通路网络 将筛选得到的信号通路和富集得到的信息，使用Cytoscape软件構建出基因-信号通路网络图，并将其可视化。

2 结果

2.1 补中益气汤活性成分的筛选及潜在作用靶点的收集 通过TCMSP检索到符合筛选标准的补中益气汤活性成分共有182个，其中甘草92个，人参22个，黄芪20个，柴胡17个，升麻17个，白术7个，陈皮5个，当归2个。然后将得到的活性成分预测作用靶点导入到Uniprot数据库进行标准化，删除重复值，最后可得到靶点基因共232个。

2.2 压力性尿失禁靶点的收集 利用GenCards、OMIM疾病数据库分别获得SUI潜在靶点1 766、45个，整合后共有1 811个SUI相关靶点。

2.3 中药-活性成分-靶点网络图分析 将筛选得到的补中益气汤所有作用靶点232个和疾病所有相关靶点1 811个进行重复比较，最终得到116个交集靶点，说明补中益气汤可通过116个靶点作用于SUI。

2.4 PPI网络分析 将2.3中获得的116个靶标导入至STRING网站进行靶基因之间的PPI分析，得到PPI网络图，并筛选出关联性为前10的Hub基因，分别为SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1，表明这些基因在补中益气汤治疗SUI的过程中具有重要意义。

2.5 GO功能富集与KEGG通路富集分析 将最终得到的116个作用靶点用DAVID数据库进行GO与KEGG富集分析，结果共有2 115条生物功能显著富集（P<0.05），1 869个在生物过程（BP）中富集，84个在细胞成分（CC）中富集，162个在分子功能（MF）中富集。显示的GO富集分析中存在3大类，即生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。在生物过程分析中，主要涉及对抗生素的反应（Response to Antibiotic）、对脂多糖的反应（Response to Lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（Response to Molecule of Bacterial Origin）、对金属离子的反应（Response to Metalion）、对乙醇的反应（Response to Alcohol）等。在细胞组分分析中，主要涉及膜筏（Membrane Raft）、膜微区（Membrane Microdomain）、膜区（Membrane Region）、小窝（Caveola）、质膜筏（Plasma Membrane Raft）等。在分子功能分析中，主要涉及核受体活性（Nuclear Receptor Activity）、转录因子活性，直接的配体调控序列-特异性DNA结合（Transcription Factor Activity，Direct Ligand Regulated Sequence-specific DNA Binding）、磷酸酶结合（Phosphatase Binding）、蛋白磷酸酶结合（Protein Phosphatase Binding）、激酶调节活性（Kinase Regulator Activity）等。

按照KEGG通路富集分析的P-value值排名，可以富集得到20条通路。补中益气汤的关键靶点主要富集的通路有以下：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、膀胱癌（Bladder Cancer）信号通路、前列腺癌（Prostate Cancer）信号通路、胰腺癌（Pancreatic Cancer）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）信号通路、乙型肝炎（Hepatitis B）信号通路、TNF信号通路（TNF Signaling Pathway）、内分泌抵抗（Endocrine Resistance）信号通路、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-associated Herpesvirus Infection）信号通路、戊型肝炎（Hepatitis C）信号通路、IL-17信号通路（IL-17 Signaling Pathway）、非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer）信号通路、爱泼斯坦巴尔病毒感染（Epstein-Barr Virus Infection）信号通路、铂耐药（Platinum Drug Resistance）信号通路、小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer）信号通路、PI3K-AKT信号通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、人巨细胞病毒感染（Human Cytomegalovirus Infection）信号通路、麻疹（Measles）信号通路、癌症中的蛋白聚糖（Proteoglycans in Cancer）信号通路、大肠癌（Colorectal Cancer）信号通路。结果表明，补中益气汤的活性成分靶点分布于不同的信号通路，说明补中益气汤可以通过对各条通路的协调作用达到治疗SUI的目的。

2.6 基因-通路网络分析 利用Cytoscape软件构建通路-活性成分-核心靶点网络，其中包含了9个核心目标基因和20条通路。图形面积越大则代表目标基因或者通路在其中发挥的作用越大。

3 讨论

中医学中并无尿失禁的病名记载，据症状多归属于“遗溺”范畴。压力性尿失禁是尿失禁中最常见的类型，其临床表现主要是当患者做咳嗽、运动、大笑等使腹压突然增加的动作时，尿液会不自主地从尿道口流出，严重者在日常生活活动时也会出现，这严重影响了患者的生命质量，损害患者的身心健康[13]。中医理论认为SUI的病因病机为冲任不固、提摄无力，治疗宜健脾益气与补肾固摄。《全书·妇人规》有“或因分娩过劳，或因郁热下坠，或因气虚下脱，大都此症当以升阳补气，固涩真阴为主”之论述[14]。补中益气汤方中黄芪味甘微温，入脾肺经，补中益气，升阳固表，故为君药。配伍人参、炙甘草、白术，补气健脾为臣药。当归养血和营，协人参、黄芪补气养血;陈皮理气和胃，使诸药补而不滞，共为佐药。少量升麻、柴胡升阳举陷，协助君药以升提下陷之中气，共为佐使。炙甘草调和诸药为使药。本研究借以补中益气汤的化学成分、靶点及通路信息等多项数据，构建网络对其功能分析，系统预测其对SUI多成分、多靶标的可能分子机制。

SUI的病理机制尚不明确，有研究表明该病的发生与盆底-组织异常胶-原代谢相关[15]，影响胶原-代谢的因素有很多，期间涉及多个功能蛋白和代谢通路。周菲菲等[16]研究探讨加味补中益气汤是否通过成纤维细胞胶原代谢治疗女性压性尿失禁。结果表明加味补中益气汤干预后I胶原蛋白及Ⅲ胶原蛋白的mRNA表达，增加尿道支撐组织的胶原含量以改善SUI症状。艾阳等[17]通过体外细胞培养研究补中益气汤治疗盆底功能障碍性疾病（包括盆腔脏器脱垂和压力性尿失禁）的作用机制，结果显示补中益气汤对TGF-β3、COL1A1、COL3A1的表达都具有上调作用。本研究基于网络药理学，分析补中益气汤治疗SUI的分子机制。发现补中益气汤中的116种成分具有治疗SUI的功效，筛选得到前10个关键活性成分为：槲皮素、山萘酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、7-O-甲基异丁香酚、利可考酮、β-谷固醇、福莫宁、美迪紫檀素、柚皮苷、糖醇。分析得槲皮素是补中益气汤的主要的活性成分，存在于黄芪和甘草中，研究表明槲皮素是广泛的激酶抑制剂能调节多种细胞信号传导途径，主要包括细胞凋亡，细胞周期停滞，核因子κB途径，MAPK途径，PI3K-AKT途径和mTOR[18]。山萘酚可以调节核因子κB、Notch等信号通路起到抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增强机体免疫等多种药理作用[19]。几种关键活性成分与疾病作用靶点联系紧密，且来源于补中益气汤的君药和臣药。通过PPI网络图分析可知补中益气汤主要通过SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1靶点发挥作用。ICAM1能够抑制淋巴因子激活的杀伤细胞与自然杀伤细胞，与各种癌症表达相关[20]。Zhou等[21]对阴道壁组织的基因进行了分析，认为ICAM1、IL6、CCNA2、ATF3等基因在SUI的发生过程中起着关键作用。Tong等[22]发现载脂蛋白E，生长因子受体结合蛋白2，高尔基体SNAP受体复合物等可能在SUI发展中起神经退行性作用。KEGG富集到的通路多涉及神经、炎症、内分泌等。Kang等[23]通过调节FAK-AMPK和Wnt/β-catenin激活骨盆底和尿道肌内的组织干细胞。马双玲等[24]对60例SUI患者研究发现TGF-β1和CTGF信号转导通路过度抑制可能与SUI患者盆底支持结构的退行性病变密切相关。黄琼[25]研究发现P44/42MAPK细胞信号通路与SUI发病相关通路受抑制后尿道支撑组织成纤维细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达量明显下降。

本研究通过数据挖掘结合网络药理学的方法，初步阐明补中益气汤多成分、多靶点、多通路治疗SUI可能存在的作用机制。考虑到网络药理学的局限性和数据分析的不全面性，后期仍需进一步临床研究或实验佐证。

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（2020-05-10收稿 责任编辑：苍宁）