3D生物打印中细胞活力的研究进展

宋春艳，马思佳 综述，钱明 审校

吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春130021

每年由于各种疾病、意外等可造成大量人体组织和器官损伤，3D生物打印是将细胞、生长因子和生物材料结合在一起，制造出模仿自然组织特征的生物医学部件，有望为人体组织和器官损伤的治疗提供新途径。3D生物打印作为组织工程的手段之一，已成为国内外研究的热点。传统生物制造技术如冷冻干燥、静电纺丝、气体发泡等［1］，尽管可制备出三维的生物构建体，但其内部结构及精确性难以控制。组织器官的相关生理活动和功能主要取决于其微观结构，如肾脏的毛细血管、心脏的心肌纤维［2］，都与其各自功能密切相关。与传统制造技术不同，3D生物打印在宏观和微观上均可以达到对结构个性化的精确控制［3］，该技术以计算机辅助设计／计算机辅助制造为基础，将细胞和生物材料等构建成具有高度复杂层次的组织器官［4］，在控制细胞分布方面有较大优势，但目前该技术仍处于发展阶段，较多方面仍不成熟，如机械强度、流变性能、生物相容性等［5］，其中，细胞活力及生物学行为是3D生物打印技术的关键之一，也是评价3D生物打印成功的重要指标。目前，国内外学者为改善并增强细胞活力和生物学行为进行了大量研究，并取得了一些进展。本文就3D生物打印中细胞活力的影响因素及提高和改善其活力的方法作一综述。

1 细胞活力的影响因素

动物细胞的体外存活对周围环境要求较高，首先要求无菌、无毒，其次需要具有充足的营养物质，包括蛋白质、糖类、脂肪、维生素等，还需具备适宜温度、pH、渗透压及一定浓度的O2和CO2。在3D生物打印的特殊条件下，细胞的活力还受其他多种因素的共同影响。

1.1 生物墨水特性 生物墨水是3D生物打印的基础和关键，主要由细胞和生物活性材料组成。理想的生物墨水应具备一定的物理、化学、生物学特性，可为细胞提供合适的微环境，支持细胞的各种活动。细胞种类对细胞活力可产生较大影响，不同种类的细胞对外界环境的敏感性也不同。干细胞由于具有无限增殖和分化潜力成为生物打印的优良选择，但与成熟体细胞相比，干细胞对恶劣环境的反应更强，不易存活［2］。另外，细胞含量也可影响细胞活力，高细胞密度可降低剪切应力，并改变墨水的流变性能，影响黏度，从而增加细胞活力［6］。

水凝胶是充满水分的三维网格状结构，可模仿细胞外基质，常作为装载细胞的生物活性材料。水凝胶的种类、浓度、黏度、刚度、交联剂的类型、交联程度等［6］均会影响细胞的活力。不同种类的水凝胶生物相容性不同，与人工合成的水凝胶比较，天然水凝胶的生物相容性更好，细胞活力更高。KOCH等［7］研究了藻酸盐、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸等多种水凝胶对细胞活力的影响，发现基于透明质酸的水凝胶的细胞生存状态最佳。ZHANG等［8］和PARK等［9］分别研究了藻酸盐浓度和成分对细胞活力的影响，结果显示，低浓度（0.8%，w／v）更有利于保持细胞活力和形态，且当藻酸盐高低分子量比例为2∶1时，最有利于细胞的增殖和分化。低浓度、低黏度、低刚度及低交联的水凝胶由于其具有疏松多孔的特性，更有利于氧气、营养物质、代谢废物的扩散及细胞的迁移，因此细胞活力更佳。另外，不同类型的交联剂毒性有所差异，3D生物打印多选择低毒甚至无毒的交联剂，毒性过大，如甲醇和戊二醛，不适用于3D生物打印［10］。

1.2 打印方法及参数 有研究显示，细胞活力与剪切应力密切相关，二者成指数关系，高剪切应力可引起细胞变形，甚至破坏细胞膜，从而导致低细胞活力［11］。不同打印方法产生的剪切应力不同，细胞活力也存在较大差异。挤压式3D生物打印由于剪切应力更大，细胞活力仅为40%~80%；喷墨式和激光辅助3D生物打印细胞活力分别高于85%和95%［10］。

对于同一种打印方法，打印参数也对细胞活力产生显著影响。喷嘴直径、形状、喷射速度、分配压力、暴露时间均可通过剪切应力影响细胞活力及打印结构，如大小、孔径、形状、孔隙率等，可通过物质交换来影响细胞的生存和生物学行为。小直径喷嘴可增加打印体的精确度，但会增加对细胞的剪切应力和挤压应力，从而削弱细胞活力［12］。研究显示，不同形状喷嘴产生的应力也不同，与圆柱形喷嘴比较，锥形喷嘴具有平滑的收缩形状，所产生的应力更小，对细胞的损伤也更低［13］。另外，有研究发现，低喷射速度、低分配压力、低暴露时间及能量激光更有利于细胞的存活［11］。由于氧气、营养物质和代谢废物的扩散距离有限，因此高孔隙率、相互贯通通道、合适的孔径、形状更有利于物质交换，而多孔结构还有利于血管形成，促进细胞生长。

2 改善细胞活力的方法

2.1 优化生物墨水 近年国内外研究发现，目前单一种类的水凝胶存在各自的局限性，因此常将不同种类水凝胶复合制备成复合水凝胶。另有多位学者通过改善水凝胶特性或开发新型水凝胶来增强细胞活力，主要有以下几种方式：优化交联过程、添加抗氧化剂、添加生物活性因子等。

2.1.1 优化交联过程 通过3D生物打印构建组织器官时，要求生物墨水能迅速从液体状态转化为凝胶状态，才能维持生物打印体的长期稳定，这主要是通过物理或化学交联实现的［14］。目前的交联剂类型和密度在一定程度上均会影响细胞活性，因此研究者尝试各种方法设计和优化交联过程。DUBBIN等［15］以藻酸盐和重组基因工程蛋白为基础设计了双组分双交联水凝胶，克服了细胞沉降、细胞膜损伤、细胞脱水的挑战，最终显著提高了细胞活力。PATTA等［16］构建了双重交联的透明质酸生物墨水，酶促反应交联适合加载细胞，可见光交联可保持打印结构的稳定性，可获得14 d的细胞活力。另外，与小分子交联剂比较，聚合物交联剂，尤其是支链交联剂，可允许通过更高密度的交联基团，多官能支化聚合物不仅参与交联，还可与其他官能团结合提高细胞活性。RUTZ等［17］利用聚乙二醇交联剂在提高支架机械性能的同时，改变了生物墨水的性能，可保持1个月以上的高细胞活力。因此，交联在3D生物打印构建组织的过程中至关重要，可通过多重交联策略、改变交联剂种类和浓度等来改善细胞活力。

2.1.2 添加抗氧化剂 由于3D生物打印过程会产生较大的机械压力和剪切应力，使细胞产生过多的活性氧和自由基，激活细胞凋亡、炎症途径。DATTA等［18］在生物墨水中添加了抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸，与对照组比较，实验组细胞活力在第1天就得到了显著改善（91%），第3天改善更加显著，对细胞凋亡和炎症标志物检测结果表明，该氧化剂在调节细胞凋亡中发挥重大作用。相对于改变挤出压力、喷嘴直径、聚合物浓度等方法，该方法促进细胞活力的效果更加明显。除了N-乙酰半胱氨酸之外，氧化石墨烯也具有抗氧化活性，可清除各种活性氧，还可吸附培养基中的蛋白质，与细胞表面的整合素结合，促进细胞的生存［19］。CHOE等［20］制备了氧化石墨烯 ／藻酸盐新型生物墨水用于骨再生的研究，以双氧水模拟氧化应激环境，结果显示，含氧化石墨烯的生物墨水更有利于间充质干细胞的存活和增殖。因此，添加抗氧化剂对于提高细胞活力是十分有效的方法，其他抗氧化剂在3D生物打印中对细胞活力的影响需进行进一步深入研究。

2.1.3 添加生物活性因子 研究表明，加入生物活性因子，如生长因子、肽序列，可改善水凝胶的生物活性、刺激细胞存活、生长和分化。生长因子是可溶于水的生理多肽，在改善生物活性、促进细胞生长和分化方面具有显著效果。目前，已有多种生长因子用于3D生物打印中，如骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7，可刺激前成骨细胞向成骨细胞分化，转化生长因子β和结缔组织生长因子可诱导成软骨，血管内皮生长因子可促进血管或神经的形成［21］。另外，有研究显示，某些生长因子可协同促进细胞的生长和分化，如血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子均可与骨形态发生蛋白协同促进骨形成［22-23］。除生长因子外，肽序列也可促进生物活性，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）可被细胞整联蛋白识别，促进细胞黏附。LOZANO等［24］使用RGD肽修饰的结冷胶作为生物墨水，进行3D生物打印构建脑样结构，与未修饰的相比，细胞黏附和增殖明显增加，活力得到改善。因此，通过生长因子、肽序列等生物活性因子来改善并增强3D生物打印中细胞活力是切实可行的，未来或许可有更多种类活性因子用于3D生物打印中。

2.1.4 其他 除了优化交联过程、添加生物活性因子和抗氧化剂之外，研究者还探讨了其他改善细胞活力的方法和策略，包括增加氧气含量、控制渗透压及添加活性成分等。氧气是细胞成活的一个重要条件，但通常情况下，3D生物打印体无充足氧气满足细胞代谢需求。为提高氧气含量，ERDEM等［25］向生物墨水中添加一定浓度的过氧化钙，既可作为氧气的来源，又降低了生物墨水的黏度，大幅提高了细胞活力。除了氧气之外，渗透压对于细胞正常的生命活动也至关重要。在3D生物打印的过程中，细胞承受的渗透压常被忽略，为证明3D生物打印过程中渗透压对细胞的重要影响，CARVALHO等［26］以蔗糖作为渗透压调节剂，结果表明，通过控制渗透压可提高3D生物打印体中细胞的活力。另外，纳米黏土是具有高生物活性的材料，可作为活性成分添加至生物墨水中，并增加材料的机械性能。蒙脱石是纳米黏土的一种，目前已被FDA批准作为药物添加剂［27］。CUI等［28］将活性材料蒙脱石引入甲基丙烯酸二醇壳聚糖的光诱导水凝胶体系，发现重量比为1.5%的蒙脱石可显著增加细胞活力，并促进体内和体外的骨再生。

2.2 优化打印方法和参数 目前，用于3D生物打印的方法主要有3种：喷墨式生物打印、挤压式生物打印、激光辅助生物打印，3种方法各有优势和局限性。为提高细胞活力和生物学行为，国内外多项研究对新型打印方式和优化打印参数进行了大量实验。

2.2.1 构建中空管道 尽管水凝胶可进行一定程度上的物质交换，但过程缓慢，且扩散距离有限，为增加氧气和营养物质的物质交换，有学者构建了可灌注的脉管系统，避免打印体内部抑制细胞活力，甚至坏死的情况。这种脉管系统多以牺牲材料为基础，要求材料打印结束后易去除，且表面张力好，打印出的结构表面光滑［29］。普朗尼克、明胶、糖基材料、琼脂糖等均可作为牺牲材料［1］。RICHARD等［30］还开发了一种新方法，以冰作为牺牲材料构建了血管结构，细胞活力有所改善。另有学者设计了多层同轴喷嘴，如JIA等［31］和ATTALLA等［32］利用同轴喷嘴，通过控制流速、打印速度、材料浓度生成了类似血管结构的可灌注空心管，在保持结构完整的前提下，还促进了细胞黏附，提高了细胞活力。因此，为增加细胞的物质交换，促进其生存，通过牺牲材料或同轴喷嘴构建中空管道模拟血管结构是行之有效的方法，未来将有更多方法来构建这种中空管道。

2.2.2 微囊化及纳米囊化 由于动物细胞无细胞壁，直接暴露于各种刺激的外界环境下，有学者提出微囊化、纳米囊化的方法，即将细胞封装于生物相容性良好的保护壳内，与周围环境隔离，来降低外界环境对细胞的刺激。微乳化、微流控技术均是微囊化、纳米囊化的有效方法，可通过产生微米级水凝胶珠来保护细胞免受外界刺激［33］。KAMPERMAN等［34］将高通量微流控技术和基于流式细胞仪的分选技术相结合，生产出单细胞微凝胶，包封率>90%，可并入生物打印的大凝胶中，且细胞在结构中均匀分布，但其未进行细胞活力检测。另外，VOSSOUGHI等［35］开发了电喷雾技术，制备了包含间充质干细胞的微囊，并观察到其具有高细胞活力。因此，微囊化和纳米囊化为3D生物打印提高细胞活力提供了新思路，目前，微囊化和纳米囊化仍处于3D生物打印研究的起始阶段，该方法将更好地改善细胞活力。

2.2.3优化打印参数 3D生物打印的打印参数也会影响细胞的生存活力，因此，国内外学者通过优化打印喷嘴直径、喷射速度、构建体的孔径、形状、孔隙率等来探讨最佳打印参数。刘煜凡等［36］分别采用直径为210、340、420μm的打印喷嘴来构建3D打印体，结果发现，420μm的打印喷嘴可保持较高细胞活力，并可促进细胞增殖。ALI等［37］以激光辅助生物打印为基础，研究喷射速度对细胞活力的影响，发现与高速喷射比较，缓慢喷射更有利于间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）的生存。DOMINGOS等［38］设计了不同内部几何形状的支架，研究支架的形态特征对细胞活力的影响，结果表明，大的四边形孔会增强MSC的活力和增殖。因此，通过优化打印参数来实现细胞活力的改善是行之有效的策略，但不同种类细胞和水凝胶的最佳打印参数不同，目前国内外学者研究的结论有所差异，尚未对具体的打印参数形成共识。

2.2.4 其他 除了上述途径提高细胞活力之外，还有学者研究出其他方法来增强细胞活力，包括压电换能器法、双通道法、显微组织构建法。高剪切应力可导致低细胞活力，为降低喷嘴内的剪切应力，KOO等［39］提出使用压电换能器辅助挤压式生物打印的创新方法，不仅降低了对细胞的损伤，还可打印高黏度生物墨水，机械强度和细胞活力均得到了改善。细胞分布不均匀也会对细胞活力产生影响，ZHAI等［40］发明了双通道方法，通过交替挤压两种不同成分生物墨水，最终获得了纳米复合水凝胶，与单通道相比，双通道方法可使细胞分布更均匀，从而增加细胞活力，促进细胞增殖。相对于单细胞悬液的接种，研究表明，大量细胞自组装成三维微组织更有利于细胞的存活［41］。JIN等［42］采用悬滴法在含有人转化生长因子β1的平滑肌诱导培养基中生成人脂肪衍生干细胞显微组织，并将显微组织进行3D生物打印，结果表明，该方法可促进细胞向平滑肌分化，并保持更高的细胞活力。

3 小结与展望

综上所述，3D生物打印的细胞活力与生物墨水特性及打印方法、参数密切相关，国内外学者也从这两个方面进行了大量探索和研究，并取得了较为丰硕的成果。但由于3D生物打印过程复杂，尚处于发展阶段，目前，仍有一些问题有待解决。首先，细胞活力受多重因素叠加的影响，且敏感性强，控制单一变量对细胞的影响是需面临的挑战之一；其次，目前3D生物打印的研究多集中在体外，更有意义的体内研究较少，今后应更关注体内的相关研究。