培养条件对百日咳杆菌发酵中百日咳毒素及丝状血凝素表达的影响

杨勇，吴永超，张飞伟，杨坤，闵宪捷，刘佐军，雍雪飞，刘少祥，潘海龙

成都生物制品研究所有限责任公司，四川成都610023

百日咳杆菌经发酵罐培养、纯化、脱毒后，获得百日咳疫苗原液，用于制备吸附无细胞百白破联合疫苗，百日咳毒素（pertussis toxin，PT）和丝状血凝素（filamentous haemagglutinin，FHA）是疫苗中最主要的抗原成分［1-4］。脱毒工艺主要是对PT进行脱毒［5］，若PT含量占比过高，将导致脱毒不完全；占比过低，将造成脱毒过度，影响PT的免疫原性。因此，原液中PT的含量比例直接影响脱毒效果，从而影响成品疫苗的毒性指标和效价。受共纯化工艺限制，生产过程中PT与FHA未进行分离，需共同进行纯化和脱毒，无法改变单一批次原液中PT和FHA含量配比［1］，因此，需在培养过程中进行调控。

百日咳杆菌生长环境的改变将影响抗原表达水平［6-8］，可通过控制培养参数调控抗原的表达水平。百日咳杆菌为好氧菌［9］，高溶氧水平有利于其生长，但不利于产毒阶段PT的表达。适当提高细菌生长阶段的溶氧水平，降低产毒阶段的溶氧水平，有利于PT的表达［10］。高剪切力对FHA有一定破坏力，在不影响细菌生长的低溶氧水平下，降低剪切力，适当提高产毒阶段的溶氧，可使FHA含量处于较高水平。目前，提高溶氧的途径有改变搅拌转速、挡板、纯氧通气量、罐内压力、搅拌叶片形状等，可通过多种控制手段组合实现发酵过程中的溶氧控制。因此，本实验通过设计不同的参数组合方案来控制溶氧水平，比较发酵物中PT和FHA的表达量来确定最佳方案。

1 材料与方法

1.1 菌种 百日咳杆菌58003（cs）株来自中国食品药品检定研究院，由成都生物制品研究所有限责任公司（简称成都公司）细菌性疫苗一室保存。

1.2 主要试剂及仪器 百日咳S-S培养基（无动物源性成分）及活性炭半综合固体培养基由成都公司培养基室提供；PT和FHA抗原含量ELISA检测试剂盒、PT和FHA抗原标准品购自NIBSC；发酵罐（百日咳50、300 L全自动发酵系统）购自成都英德生物工程有限公司；溶氧检测电极（Mett1er Tor1edoinpro6830）购自梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司。

1.3 发酵种子的制备 将百日咳杆菌接种至活性炭半综合固体培养基，于36℃培养72 h；按1∶3的比例进行传代，36℃培养48 h；按1∶5的比例继续传代，36℃培养48 h；按1∶30的比例接种于百日咳S-S液体培养基培养（50 L发酵罐），于36℃培养32 h，作为发酵种子进行后续试验。

1.4 发酵培养 采用300 L全自动发酵罐进行百日咳杆菌发酵培养，培养基为百日咳S-S培养基，搅拌通气培养，培养量200L，温度35～37℃，培养时间40h，接种比例1∶12~1∶15。试验分为3组：高PT表达组、高FHA表达组及对照组，每组平行培养3批培养物，批号分别为1～3、4～6、7～9。高PT表达组搅拌转速为160 r／min，搅拌叶片为直叶，有挡板，培养0～20及21～40 h通气量分别为600和400 L／min；高FHA表达组搅拌转速为220 r／min，搅拌叶片为弯叶，无挡板，培养0～20及21～40 h的通气量分别为400和600 L／min；对照组搅拌转速为180 r／min，搅拌叶片为直叶，有挡板，培养0～40 h通气量均为500 L／min。

1.5 生长曲线的绘制 每批培养物培养过程中，0～12 h每4 h取1次样，12 h后每2 h取1次样，用分光光度计检测A550，以培养时间为横坐标，A550为纵坐标，绘制培养物生长曲线。

1.6 溶氧量的检测 每批培养物培养过程中，0～12 h每4 h取1次样，12 h后每2 h取1次样，通过发酵系统在线溶氧电极检测溶氧量，以培养时间为横坐标，溶氧量为纵坐标，绘制培养物溶氧曲线。

1.7 P T和FHA含量的检测 每批培养结束后，取样，3 600×g离心10 min，取上清，采用PT和FHA抗原含量ELISA试剂盒进行定量测定［11-12］。用NIBSC的PT和FHA标准品绘制标准曲线，对A450和A630进行四参数曲线拟合，计算PT和FHA含量［13-14］。

1.8 统计学分析 应用Excel 2019和Origin 9.0软件进行统计学分析，有效抗原含量的检测结果组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养物的生长曲线 各组培养物生长趋势基本一致，见图1。表明发酵参数的改变未影响百日咳杆菌生长。

图1 各批培养物的生长曲线Fig.1 Growth curve of cultures of various batches

2.2 溶氧曲线 培养20 h（产毒期）时，高PT表达组溶氧水平大幅下降，高FHA表达组溶氧水平略微升高，随后下降。培养22 h时，高FHA表达组的溶氧量高于高PT表达组和对照组。见图2。

图2 各批培养物发酵过程中溶氧量的变化趋势Fig.2 Change trends of DOin cultures of various batches

2.3 P T和FHA含量 高PT表达组PT含量平均值达3.16μg／mL，比对照组（平均值2.23μg／mL）提升了41.7%（t=6.14，P=0.025）；高FHA表达组FHA含量平均值达21.37μg／mL，比对照组（平均值11.00μg／mL）提升了94.3%（t=8.86，P=0.013）。见表1。表明在培养阶段，通过参数控制，可提高培养物中PT及FHA的表达量。

表1 各批培养物中PT及FHA的含量（μg／mL）Tab.1 PT and FHA contents in cultures of various batches（μg／mL）

3 讨论

共纯化工艺生产的无细胞百白破联合疫苗中，无细胞百日咳组分的生产和脱毒工艺尤为复杂，生产难度较高，因此，针对PT和FHA两个主要抗原生产工艺的优化尤为重要。本研究从发酵工艺参数的控制入手，有效提高了百日咳杆菌培养物中单个组分（PT或FHA）的表达量（P<0.05）。实验中的参数控制主要反映在溶氧水平和搅拌剪切力两方面，影响这两项指标最主要的因素是有无挡板、搅拌叶片的选择和通气量的大小。高PT表达组安装有挡板，直叶的搅拌剪切力较大，溶氧水平会较高，因此在产毒阶段适当降低通气量，保持产毒阶段［9］的低溶氧水平，利于PT的表达；较高的剪切力对FHA有一定破坏，使高PT表达组的PT含量较高，FHA含量较低。高FHA表达组虽然提高了通气量和搅拌转速，但去掉了挡板，搅拌叶片也改为弯叶，目的是适当降低剪切力，保护FHA不被破坏，同时增大了通气量，保持产毒阶段的高溶氧水平，适当限制PT的表达，使FHA含量比例处于较高水平。上述结果表明，在百日咳杆菌发酵工艺中，高搅拌剪切力和较低的溶氧水平有利于PT的表达，低剪切力和高溶氧水平有利于提高FHA的产量。

综上所述，本研究通过控制发酵参数，有效提高了PT和FHA的表达水平，有望用以指导实际生产中获得理想的PT与FHA占比的百日咳抗原，同时对减小批间差异，提高百日咳抗原的脱毒效果和百日咳原液的效价均具有重要意义。另外，其他的研究方向，如发酵过程中酸碱度的控制［10］、培养基成分的优化［15-16］、过程中生长因子［17］的补加、培养温度等，也可能对PT和FHA的表达水平有较大影响，需步深入研究。