miRNA-4429靶向结合MCL1调控食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移与侵袭的机制研究

陆晓东 姚安军 李静云 陈凌子 唐志苗 金霞云

食管癌是最常见的癌症之一，其死亡率居全球恶性肿瘤的第6位[1]。食管鳞状细胞癌是食管癌的主要病理类型，占食管癌病例的90%以上[2]。尽管手术治疗、放射治疗及化学治疗在食管鳞状细胞癌治疗方面取得较大进展，但食管鳞状细胞癌发病率和病死率依旧较高。因此，深入研究食管鳞状细胞癌发生、发展的分子机制具有重要的临床意义。miRNA是一类内源性非编码单链RNA，长度为21～24个核苷酸，具有高度保守性，参与调控癌细胞生长、分化、迁移、侵袭和凋亡等生物学过程，与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。近年来大量文献表明，miRNA的异常表达参与食管鳞状细胞癌进程，如miRNA-134[4]、miRNA-34a[5]、miRNA-216a-5p[6]和 miRNA-204-5p[7]等，而miRNA-4429在食管鳞状细胞癌中的作用尚鲜见报道。基于此，本研究探讨miRNA-4429靶向结合髓样细胞白血病-1（MCL1）对食管鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 人食管鳞状细胞癌细胞株（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）、293T 细胞株和人食管正常上皮细胞株Het-1A均购自上海中国科学院细胞库；RPMI1640 培养基（批号：21870084）、FBS（批号：10091148）和 DMEM 培养基（批号：11995065）均购自美国Gibico公司；模拟物对照（mimics NC）和miRNA-4429模拟物（miRNA-4429 mimics）均购自上海吉玛制药公司；脂质体转染试剂（批号：11668019）购自美国 Invitrogen公司；Trizol试剂（批号：R401-01）、凋亡检测试剂盒（批号：A211-01）、逆转录试剂盒（批号：MR101-01）和qRT-PCR试剂盒（批号：MQ101-01）均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Transwell小室（批号：3422）和Matrigel基质胶（批号：354248）均购自美国Corning公司；CCK-8试剂盒（批号：C0037）购自上海碧云天生物技术研究所；TBST缓冲液（批号：T1085）购自北京索莱宝科技有限公司；MCL1抗体（批号：94296）购自美国Cell Signaling Technology公司。Multuskan Go 1510酶标仪购自美国Thermo公司；QTOWER 2.2荧光定量PCR仪购自德国analytikjena公司；奥林巴斯x71显微镜购自上海无陌光学仪器有限公司；化学发光凝胶成像系统Tanon-5200Multi购自上海天能科技有限公司；CytoFLEX S型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2 细胞培养和转染 将EC9706细胞用含10%FBS的DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。取处对数生长期的EC9706细胞，以每孔5×105个接种于6孔板，待细胞融合度达到60%～70%时将培养液更换为无FBS培养液。按LipofectamineTM2000说明书，分别将miRNA-4429 mimics、mimics NC与脂质体试剂混合均匀并静置20 min后，转染至EC9706细胞，并分为实验组和对照组，转染4～6 h后，更换为正常的完全培养基。次日收集转染后的细胞，检测实验组和对照组miRNA-4429相对表达量。

1.3 miRNA-4429相对表达量检测 采用qRT-PCR法。收集细胞后加入1 ml Trizol，按照Trizol说明书进行总RNA的提取。所有样本均取1 μg RNA逆转录为cDNA。qRT-PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40个循环。引物序列如下：miRNA-4429上游引物为5'-CGCGAAAAGCTGGGCTGA-3'，下游引物为 5'-AGTGCAGGGTC－CGAGGTATT-3'；U6上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以 U6 为内参，采用 2-ΔΔCt法计算 miRNA-4429相对表达量。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。收集转染后的EC9706细胞，计数后每孔以2×103个细胞接种于96孔板，每组设置9个复孔，每隔24 h在固定时间点每孔加入10 μl CCK-8反应液于37℃孵育4 h，通过多功能酶标仪测定450 nm波长下的吸光度（OD）值，测定时间点分别为24、48、72和96 h，绘制增殖曲线。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞克隆能力检测 采用集落形成实验。收集转染后的EC9706细胞，计数后每孔以500个细胞接种于6孔板，每组设置3个复孔，每48 h更换1次培养液，培养2周后弃去培养液，用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，PBS洗涤并干燥后拍照，在显微镜下计数并分析集落形成数。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化转染后的EC9706细胞，终止消化后收集 5×105个细胞，1 000 r/min、4 ℃离心 5 min，弃上清液。用预冷的PBS洗涤细胞两次，1 000 r/min、4℃离心 5 min，弃上清液。加入 100 μl 1×Binding Buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI Staining Solution，轻轻吹匀；避光、室温 20～25 ℃孵育 10 min；加入 400 μl 1×Binding Buffer，轻轻混匀。染色后样品在1 h内用流式细胞仪进行检测。每组实验设计3个复孔，取平均值。

1.7 细胞迁移和侵袭数检测 采用Transwell小室实验。收集转染后的EC9706细胞，经过离心后采用无血清DMEM培养基重悬计数后，稀释成1×106个/ml的细胞悬液，取100 μl铺板于Transwell上室，下室加入700 μl含20%FBS的DMEM培养基。培养24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min后，用棉签将上室未迁移的细胞擦拭干净，结晶紫染色1 h，PBS洗涤后，显微镜下拍照并计算细胞迁移数。细胞侵袭实验则需要提前将基质胶均匀铺于Transwell上室并置于培养箱过夜成膜，后续操作按照细胞迁移实验步骤，显微镜下拍照并计算细胞侵袭数。每组实验设计3个复孔，取平均值。

1.8 miRNA-4429靶基因预测及荧光素酶报告基因实验 采用miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、miRDB（http://mirdb.org/miRDB/）和 miRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/search.php/）在线预测miRNA-4429靶基因。采用荧光素酶报告基因实验验证miRNA-4429是否靶向结合MCL1。将野生型或突变型（突变MCL1与miRNA-4429结合位点）的MCL1 3'非编码区（3'UTR）片段分别插入到荧光素酶报告基因质粒（pMIR-REPORT Luciferase），内参为 β-gal质粒（pMIR-REPORT β-gal control plasmid）。将 293T 细胞接种于24孔板中，细胞密度为1×106个/孔，培养24 h后进行转染，转染前每孔用PBS洗一遍，并将培养基更换为Opti-MEM培养基，每孔400 μl；将0.8 μg质粒（0.5 μg相应的荧光素酶报告基因质粒和 0.3 μg β-gal内参质粒）加入50 μl Opti-MEM培养基中，LipofectamineTM2000加入50 μl Opti-MEM培养基中混匀，静置5 min后两者轻轻混匀，再静置20 min之后加入24孔板中。37℃、5%CO2条件下培养4～6 h后，将Opti-MEM换成含有2%FBS的培养基，每孔 400 μl，将15 pmol miRNA-4429模拟物或阴性对照加入50 μl Opti-MEM 培养基中，LipofectamineTM2000加入 50 μl Opti-MEM培养基中混匀，静置5 min后两者轻轻混匀，再静置20 min之后加入24孔板中。转染48 h后，收集细胞裂解液，进行Luciferase和β-gal的测定，计算荧光素酶相对活性。每组实验设计3个复孔，取平均值。

1.9 MCL1蛋白表达水平检测 采用Western blot法。收集转染后实验组和对照组EC9706细胞，用PBS洗涤两遍后，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液用于总蛋白的提取，采用BCA试剂盒测定各组蛋白浓度。每组取40 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过湿转法将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。TBST溶液洗膜2～3次后，加入MCL1 抗体（1∶1 000）或 GAPDH 抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜2～3次后，加入过氧化物酶标记的抗兔或过氧化物酶标记的抗鼠的二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，TBST溶液洗膜2～3次后，加入显影液显影。以GAPDH为内参蛋白，实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 miRNA-4429相对表达量比较 4株食管鳞状细胞癌细胞中miRNA-4429相对表达量均明显低于食管正常上皮细胞，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1。而与对照组比较，实验组细胞中miRNA-4429相对表达量显著上调（P＜0.01），见表2。

表1 食管鳞状细胞癌细胞与食管正常上皮细胞中miRNA-4429相对表达量比较

表2 实验组和对照组细胞miRNA-4429相对表达量比较

2.2 两组细胞增殖和克隆能力比较 实验组细胞OD值在72、96 h均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图1a。与对照组比较，实验组细胞集落形成数明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1b、表3。

表3 两组细胞集落形成数比较（个/视野）

图1 两组细胞增殖和克隆能力比较（a：两组细胞增殖能力比较；b：两组细胞克隆形成能力比较）

2.3 两组细胞凋亡率比较 与对照组比较，实验组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2、表4。

表4 对照组和实验中EC9706细胞凋亡率的比较

图2 两组细胞凋亡情况的比较

2.4 两组细胞迁移和侵袭数比较 实验组细胞迁移数及侵袭数均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图3（插页）、表5。

表5 两组细胞迁移、侵袭数比较（个/视野）

2.5 荧光素酶报告基因实验结果及两组MCL1蛋白表达水平比较 miR-4429与MCL1的3'UTR区结合位点见图4a。共转染MCL1 3'UTR-野生型荧光素酶报告载体后，与对照组比较，实验组荧光素酶相对活性降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而共转染MCL1 3'UTR-突变型荧光素酶报告载体后，实验组与对照组荧光素酶相对活性比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图4b。实验组MCL1蛋白表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 4c。

3 讨论

食管鳞状细胞癌是人类最致命的恶性肿瘤之一，具有转移快、治疗难和复发率高等特点[8]。在中国，食管鳞状细胞癌占据食管癌病例的90%以上[9]。研究食管鳞状细胞癌发生、发展的相关潜在机制对于提高患者的总体生存率是非常必要的。据报道，miRNAs在细胞生长、凋亡和分化等生物学过程中均起着重要的调控作用。研究表明miRNA-4429在卵巢癌[10]、胃癌[11]、宫颈癌[12-14]、脑胶质瘤[15]、结直肠癌[16]、子宫内膜癌[17]、甲状腺乳头状癌[18]和肾透明细胞癌[19]中均呈低表达，参与肿瘤发生、发展，并起到抑癌的作用。目前关于miRNA-4429是否参与食管鳞状细胞癌发生的研究尚鲜见报道。

本研究对食管鳞状细胞癌细胞株（TE-13、KYSE140、EC9706、KYSE30）和食管正常上皮细胞株Het-1A中miRNA-4429相对表达量进行检测，结果发现miRNA-4429在食管鳞状细胞癌细胞株中呈低表达，提示miRNA-4429可能在食管鳞状细胞癌中发挥抑癌作用。为进一步探索miRNA-4429在食管鳞状细胞癌发生、发展中的作用，本研究对EC9706细胞进行转染miRNA-4429 mimics。CCK-8、集落形成实验和Transwell小室实验结果显示，实验组较对照组EC9706细胞的体外增殖能力显著抑制，克隆形成数目降低，迁移和侵袭能力降低。凋亡调控的失衡是肿瘤发生、发展的重要过程，本研究采用流式细胞术检测EC9706细胞凋亡情况，结果发现miRNA-4429过表达可通过促进凋亡进而抑制EC9706细胞的增殖能力。一项关于脑胶质瘤的研究也发现miRNA-4429抑制剂可显著抑制细胞凋亡，从而促进脑胶质瘤细胞的增殖[15]。以上结果均表明miRNA-4429的异常表达可能参与食管鳞状细胞癌的进程。

研究发现，miRNA可直接互补结合下游靶基因的3'UTR，干扰靶基因的表达。本研究通过miRWalk、miRDB和miRTarBase预测miRNA-4429可能结合的靶基因，发现MCL1可能是miRNA-4429的作用靶基因。荧光素酶报告基因实验的结果显示，共转染MCL1 3'UTR-野生型荧光素酶报告载体后，与对照组比较，实验组荧光素酶相对活性降低；而共转染MCL1 3'UTR-突变型荧光素酶报告载体后，实验组与对照组荧光素酶相对活性比较差异无统计学意义，表明miRNA-4429可靶向结合MCL1。MCL1基因是细胞凋亡的关键调控因子，也是近年来促癌基因研究的热点之一。MCL1在胃癌[20]、卵巢癌[21]、宫颈癌[22]以及食管鳞状细胞癌[23]等恶性肿瘤的发生、发展进程中起促进作用，扮演着促癌基因的角色。本研究结果表明上调miRNA-4429表达水平可显著抑制MCL1的蛋白表达，说明miRNA-4429可靶向结合并负调节MCL1的表达，进而抑制食管鳞状细胞癌的发展。

综上所述，miRNA-4429在食管鳞状细胞癌细胞中的表达下调，上调miRNA-4429的表达可抑制EC9706细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提高EC9706细胞凋亡率，具体的作用机制可能为miRNA-4429靶向结合并降低MCL1的表达，从而干扰MCL1的促癌作用。本研究提示，miRNA-4429可能为食管鳞状细胞癌发生和发展的潜在预测分子和治疗靶点。