超分支滚环扩增法检测美洲鳗鲡嗜水气单胞菌

张世佳,冯建军,郭松林,王艺磊,林 鹏

(1.集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建 厦门 361021)

0 引言

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是一种人鱼畜共患的病原菌，其存活范围广，能适应多种复杂环境。该菌可致人、鱼、畜感染，同时伴随出血性败血症，严重可致死[1]。在鱼类养殖环境中也会引起细菌性败血症，造成严重的经济损失。传统的检测方法主要有分离培养法和生理生化法[2]，但这些方法检测周期较长，不能满足快速检测的要求。免疫检测法快速简单、特异性强，然而灵敏度不高[3]。分子检测手段(如PCR法[4])特异性强、灵敏度高，但需要较为昂贵的变温仪器，只适合在实验室检测。

基于锁式探针(padlock probe)[5]的超分支滚环扩增(hyper-branched rolling circle amplification,HRCA)是一种恒温核酸扩增检测法。该方法的原理是，设计特异性的锁式探针与一对通用引物，锁式探针的两端与目标DNA通过互补连接成环，通用引物识别环状锁式探针，实现对锁式探针的超分支滚环扩增，从而达到信号放大的目的[6]。该技术依赖于探针，只有在两端的捕捉序列与目标DNA完全互补配对的前提下才能成环，因此检测特异性强，已成功应用于医学[7]、食品[8]、农业[9]等领域。HRCA由于是恒温扩增，不需要昂贵的仪器，恒温水浴锅便可进行恒温扩增，并和纸基传感器技术相结合[10]，可以直接读取结果。本研究首次将HRCA法应用于水产病原菌嗜水气单胞菌的检测，并在实际样品的提取中应用水煮法[11]，简化了处理步骤。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验菌株

嗜水气单胞菌B11分离于病变鳗鲡，并经Biolog自动生化鉴定系统(GeneⅢ)鉴定为嗜水气单胞菌[12]。特异性交叉实验所用菌株均来自西班牙普通微生保藏中心(CETC)。

1.1.2 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒(GK4003-100)购自上海捷瑞生物工程有限公司;T4 DNA连接酶、Bst DNA 聚合酶、Exonuclease Ⅰ、Exonuclease Ⅲ、dNTPs源自美国Biolabs公司；锁式探针和引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3 主要仪器

HH·S21-4-S恒温水浴锅购自上海坤诚公司；GelDoc-It2 310凝胶成像仪购自美国UVP公司。

1.2 实验方法

1.2.1 探针及引物设计

选取一段嗜水气单胞菌独有的AER基因序列(NC_008570)[13]，采用Primer Premier 5.0及Oligo软件设计探针，探针两端的捕捉序列与待检目标序列靶标互补[14](见表1，锁式探针中的大写字母序列)，探针中间的连接序列采用与嗜水气单胞菌序列相差极大的野猪MSTN中的一段特异性序列作为连接序列和引物扩增的结合序列(见表1，锁式探针中的小写字母序列)。采用TheMFold(http://www.unafold.org/hybrid2.php)预测探针的结构，以确保二级结构能值最小，防止发夹结构的产生，同时探针的5′端进行磷酸化修饰，便于环化后探针3′和5′端的末端粘合。针对探针设计一对通用引物P1和P2用于探针的扩增。

表1 锁式探针及引物

1.2.2 DNA提取

根据基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 连接反应

10 μL的连接反应体系:10×T4 DNA ligase buffer(50 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、50%甘油)1 μL，400 U/μL T4 DNA 连接酶1 μL，250 nmol/L探针1 μL、DNA模板2.5 μL、用无菌双蒸水补至10 μL。体系在16 ℃下反应1 h，然后65 ℃温育20 min后停止反应。

1.2.4 外切酶处理

连接反应体系中还有许多双链和单链DNA，会在扩增的过程中产生背景信号，可能导致假阳性的结果[15]，采用Exonuclease Ⅰ和Exonuclease Ⅲ对产物进行处理，除去连接产物中未成环的探针和DNA模板[16]。20 μL酶切体系：连接产物10 μL，20 U/μL Exonuclease Ⅰ 1 μL，100 U/μL Exonuclease Ⅲ 1 μL，10×buffer(67 mmol/L Glycine-KOH、1 mmol/L DTT、6.7 mmol/L MgCl2)2 μL,用无菌双蒸水补至20 μL。酶切体系37 ℃反应2 h，然后85 ℃温育20 min后停止酶切。

1.2.5 HRCA扩增反应

HRCA反应的25 μL扩增体系：经外切酶处理后的连接产物4 μL，10 μmol/L P1 1.25 μL，10 μmol/L P2 1.25 μL，10 μmol/L dNTPs 0.75 μL，4 U/μLBstDNA 聚合酶1 μL，10×BstDNA polymerase buffer(20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L (NH4)2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1%Triton X-100) 2.5 μL，用无菌双蒸水补至25 μL。在63 ℃下扩增反应1 h。

1.2.6 扩增产物凝胶电泳

取5 μL HRCA产物用2%(质量分数)琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色，紫外凝胶成像系统照相分析。

1.2.7 HRCA检测的特异性

分别选取了副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)、维氏气单胞菌(Aeromonasvickers)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharvey)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)7种菌株，划线挑菌后过夜培养，经平板计数法确定浓度后，稀释为1×108cfu/mL的菌液。然后，提取DNA，按照上述步骤进行连接、酶切、扩增，进行HRCA检测，同时以嗜水气单胞菌菌株B11作为阳性对照、无菌双蒸水作为空白对照，产物用2%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.8 HRCA检测的灵敏度

选用嗜水气单胞菌B11作为阳性菌，活化菌株，制作成1×106cfu/mL的菌悬液。用0.9%(体积分数)的无菌生理盐水对嗜水气单胞菌的菌液进行10倍梯度稀释，稀释到1×102cfu/mL,对不同稀释度的菌液提取DNA作为模板，在1×102～1×106cfu/mL范围内进行HRCA检测，以确定HRCA检测体系的灵敏度。

1.2.9 HRCA实际样品检测

将购买的美洲鳗鲡(Anguillarostrata)经饥饿处理3 d后，将嗜水气单胞菌用0.9%(体积分数)无菌生理盐水稀释为2×107cfu/mL，注射到鳗鲡腹腔内，同时设立1组只注射0.9%无菌生理盐水[17]的作为对照组。7 d后选择无明显发病的鳗鲡，取其0.5 g肌肉组织，匀浆后沸水加热10 min，取上清液2.5 μL用于检测[11]。

2 结果

2.1 嗜水气单胞菌HRCA检测体系的建立和优化

2.1.1 锁式探针浓度的确定

按照1.2.3所述的锁式探针连接反应条件，设置6个锁式探针浓度分别为25 pmol/L、250 pmol/L、2.5 nmol/L、25 nmol/L、250 nmol/L和2.5 mmol/L，连接反应后依据1.2.4和1.2.5步骤进行酶切与HRCA扩增反应，产物的电泳结果见图1。当探针浓度大于或等于25 nmol/L时，条带亮度相近并且清晰；而低于此浓度，电泳条带基本看不到。因此选择25 nmol/L作为反应体系的探针浓度。此外，凝胶电泳结果呈阶梯状分布，条带的大小依次为102 bp的整数倍，这证明电泳的结果与理论值是一致的。

2.1.2 HRCA扩增温度的确定

HRCA反应中不同扩增温度的结果见图2。温度为51 ℃和54 ℃时，没有条带； 57 ℃时，开始有条带产生，但不够清晰；60 ℃和63 ℃时，条带最为清晰；66 ℃时，条带模糊不清，没有阶梯状条带产生。故选择63 ℃作为扩增的温度。

2.2 HRCA检测的特异性结果

HRCA特异性检测结果见图3。8株实验菌株中，只有嗜水气单胞菌B11可以检测出，其余7株对照菌株均不能检出。这表明，HRCA检测体系可以特异性地检测出嗜水气单胞菌，特异性良好，适用于嗜水气单胞菌的检测。

2.3 HRCA检测的灵敏度结果

HRCA检测的灵敏度实验结果见图4。其最低检测浓度为1×103cfu/mL，在该浓度时可以检测得到，但条带较微弱；小于该浓度时条带已经不可见；浓度在1×104～1×106cfu/mL时，条带清晰可见。而常规的PCR检测手段只能检测到3×104cfu/mL[18]。

2.4 HRCA实际样品检测结果

嗜水气单胞菌感染美洲鳗鲡的检测实验结果(见图5)表明，感染的美洲鳗鲡样品条带清晰可见，注射无菌生理盐水的健康鳗鲡样品无条带出现。这证明HRCA法能够从感染的鳗鲡样品中检测出嗜水气单胞菌，该法可用于水产生物病原菌感染的检测。

3 讨论

滚环扩增检测技术依赖于锁式探针对目标DNA的特异性结合[19]，只有探针两端的捕捉序列与待检的目标序列完全互补结合[20]，T4 DNA 连接酶才能将锁式探针连接环化，若有一个碱基错配，探针的连接就无法进行[21]，从而保证了检测的特异性。此外，HRCA检测的实质是对连接成环的探针进行扩增[22]，并非对目标DNA序列进行扩增[23]，既减少了交叉污染，也最大限度地减少了实际样品中抑制因子对检测的影响[24]，从而放大了信号值，有助于检测灵敏度的提高。

由于HRCA法扩增的是环状探针，因此没有成环的线性探针和目标DNA会对扩增产生背景信号，影响灵敏度，为此本研究加入了Exonuclease Ⅰ和Exonuclease Ⅲ,特异性地降解掉了未成环的单链探针[25]和未反应的DNA模板[26]，效果良好。锁式探针的浓度对HRCA检测至关重要。浓度过低，成环的探针少，导致HRCA的检测信号低，不能如实反映嗜水气单胞菌的真实含量；浓度过高，有可能降解不完全，使得背景信号增大。本检测的最佳浓度为25 nmol/L。HRCA的反应温度包含锁式探针连接温度和扩增反应温度。连接温度是由T4 DNA连接酶决定。T4 DNA连接酶有最适反应温度，根据试剂盒说明书，其最适反应温度为16 ℃。而扩增反应温度是由Bst DNA 聚合酶的最适反应温度决定的。实验证明，在60 ℃和63 ℃时，条带最为清晰，而超出了此温度范围，则没有条带或者条带不清晰，即60～63 ℃为Bst DNA 聚合酶的最适温度。因此，本研究选用63 ℃为HRCA反应的扩增温度。

用分子生物学手段检测嗜水气单胞菌，相较于传统的细菌培养和免疫法，具有突出的优点——灵敏度高、特异性强，但其缺点也显而易见——需要较为昂贵的变温仪器。对于PCR方法[27],如果要做不同菌的高通量检测，需要设计不同的引物进行多重PCR，这不可避免地产生多重PCR假阳性和不同引物相互影响扩增效率的问题。而采用HRCA法检测嗜水气单胞菌，其灵敏度为1×103cfu/mL，高于免疫法的4.0×104cfu/mL[3]和PCR法的3×104cfu/mL[18]；并且不需要PCR仪，采用恒温水浴锅即可进行扩增，大大简化了处理步骤；此外，相较于PCR方法，锁式探针的设计在保证中间连接序列不变的前提下，针对不同目标序列设计不同的捕捉序列，即可用一对引物扩增多种探针[28]，可高通量[29]、多靶标检测[30]，克服了多重PCR进行多种病菌检测时的不利影响。

4 结论

本文首次应用HRCA法进行了嗜水气单胞菌的检测。该法灵敏度高、特异性强，样品处理简单，不需要昂贵的仪器，有可能在水产养殖现场检测中得到推广应用。基于锁式探针的特点，后续研究可以根据中间连接序列设计一对通用引物，针对不同菌的目标序列设计不同的捕捉序列，实现多种水产病原菌的高通量检测，为水产病害的鉴定及制定治疗方案提供更简洁、快速、高效的检测方法。