一株木霉菌的鉴定及其重金属-抗生素的复合抗性

林锦美，陈锦芳，段金明，张金丽，陈文熙

(1.集美大学港口与海岸工程学院， 福建 厦门 361021；2.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)

0 引言

抗生素保障了人类及动物健康，促进了畜禽养殖业发展。抗生素早期对致病微生物具有良好的抑制作用，使得其在日常生活中的使用越来越频繁甚至滥用,因此，大量的携带有抗生素的代谢物和废弃物进入自然环境中，加剧了环境中微生物的抗性压力。已有的研究报道[1]，抗性基因很大程度上是由抗生素诱导而产生，该状况加速了大量抗性微生物的出现，因此，抗生素耐药性对全球人类健康构成威胁。随着工业的发展，重金属暴露在环境中的数量也越来越多，并和抗生素发生各种复合作用，通过协同、交叉等机制加剧了抗生素抗性基因的污染。研究表明[2-4]，sul1、tetM、tetQ、ermB、mefA等基因与环境中Cr6+、Cd2+等重金属浓度也有着显著关联作用。

霉菌作为一类广泛存在于土壤、腐烂植物体表面以及重金属污染度较高的多种生态环境中的真核微生物，对植物病原真菌具有拮抗和重寄生作用[5-6]，产生对抗生素、重金属离子等环境响应的酶如纤维素酶等[7-8]，在工业、农业、环境保护等领域有着广泛的应用前景[9]。

本文从复合污染的环境中筛选获得抗性霉菌，以抗生素-重金属复合抗性菌为研究对象，进行了抗性菌的鉴定及其抗性研究。将头孢拉腚、盐酸黄连素等抗生素和Cr6+、Cd2+、Cu2+等重金属进行组合以获得不同培养条件，分析菌体对复合污染环境的响应，以菌体浓度、蛋白质含量、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量为指标，方差分析获得重金属、抗生素污染与抗性菌生长之间的相关性，进一步探究木霉菌的抗性变化及其机理，为重金属与抗生素复合污染环境下微生物的抗性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

1.1.1 菌种和培养基 菌株LJM-001分离于腐烂植物根部，并通过ITS分子鉴定保存于-80 ℃备用。PDA培养基制备：分别将马铃薯200 g、葡萄糖25 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾2 g、硫酸镁2 g溶于1 000 mL无菌蒸馏水中，灭菌(121 ℃，20 min)后冷却倒置保藏备用。

1.1.2 模拟废水配制 抗生素溶液的配制：盐酸黄连素、头孢拉腚储备液使用灭菌的超纯水配制，采用0.45 μm微孔滤膜将储备液过滤，避光保存于冰箱，保存时间不超过一周。模拟重金属(Cr6+、Cu2+和Cd2+标准液)废水：分别称取K2Cr2O7固体1.413 g、CuSO4·5H2O固体3.906 g、CdSO4·7H2O固体2.291 g，分别溶于1 000 mL无菌蒸馏水中，配制好模拟废水污染液，保存于棕色试剂。

1.1.3 仪器和试剂 显微镜(OLYMPUS生物显微镜)；PCR仪9700(美国ABI公司)；测序仪3730(美国ABI)；电泳仪DYCP-31DN(北京六一仪器厂)；紫外可见分光光度计(UV751 GD)；摇床(ZHWY-2112B)；智能生化培养箱(PHX)；台式高速离心机(H1650)；XPS能谱仪(PHI Quantum 2000)。酵母基因组提取试剂盒(Rapid Yeast Genomic DNA Isolation Kit)；DNA聚合酶；真菌通用引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；低粘度树脂包埋试剂盒(Spurr Embedding Kit)；考马斯亮蓝法蛋白质试剂盒；dNTPs；CuSO4·5H2O；HNO3；NaOH试剂；谷胱甘肽，可溶性淀粉，均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 优势霉菌的分离纯化 参照程丽云等[10]的方法，从腐烂植物根部经选择性培养基分离得到生长良好的霉菌，通过平板划线分离以获得单菌落，并通过斜面试管保藏法保存。

1.2.2 木霉菌特征和形态鉴定分析 将菌株LJM-001接种于马铃薯固体培养基，24 ℃恒温培养箱倒置培养72 h，观察菌丝生长初期，使用插片法观察并记录菌落特征。通过光学显微镜观察菌株分枝状况和形态特征以对菌株进行初步鉴定。

1.2.3 霉菌总DNA的提取 参照酵母基因组提取试剂盒(Rapid Yeast Genomic DNA Isolation Kit)说明书进行DNA提取。

1.2.4 PCR扩增ITS区 以菌株基因组为扩增模板，使用50 μL体系，依次加入双蒸水、缓冲液、dNTP 38，5，2 μL，再加入ITS引物4 μL、DNA聚合酶1 μL、纯化后的霉菌DNA 2 μL，经过变形、退火、延伸等步骤扩增30个循环。

1.2.5 扩增产物的测序 扩增产物进行Sanger一代测序(上海生工生物工程有限公司)。将测得的序列通过DNAstar(v6.13)将双端序列融合成一条完整序列，然后将DNA序列提交至NCBI数据库以获得菌株详细分类信息，并下载同源菌株序列，利用软件MEGA5.03和Figtree进行比对分析，构建物种进化系统发育树。

1.2.6 复合污染实验过程 根据文献[11-12]的研究结果，重金属和抗生素对微生物复合污染实验选取的浓度如下：抗生素盐酸黄连素、头孢拉腚的质量浓度设为0，5，25，50，100，200 mg/L。将制备好的重金属Cr6+、Cd2+和Cu2+标准液浓度分别稀释为0，5，10，50，100，200 mg/L 6个浓度梯度。通过两两组合按照浓度梯度进行实验，并接种培养相同时间，然后分别测定不同抗生素浓度和不同重金属浓度组合中菌种的干重、GSH含量以及蛋白质含量等，从而表征抗生素与重金属复合污染对霉菌生长情况的影响以及霉菌在生长过程中对复合污染的响应机制。

1.2.7 GSH提取及测定 通过热水抽提法测定GSH的含量，将1 g干菌粉溶于4 mL蒸馏水后并加入5 mL沸水，充分溶解后95 ℃水浴10 min，及时取出并进行冷却处理，5 000 r/min 10 min离心处理，通过碘量法[13]测定提取溶液中GSH含量。

1.2.8 蛋白质提取及测定 破碎菌体并离心(4 000 r/min，15 min)，取上清液加入硫酸铵，4 ℃盐析并离心，收集蛋白质沉淀。然后利用磷酸盐缓冲液(pH=7.0)溶解，并过滤。最后将过滤后的蛋白质复溶于缓冲液中。考马斯亮蓝法测定组织中的蛋白质含量并记录。蛋白质标准液为0.563 g/L，取0.05 mL稀释成50倍的待测酶样、0.05 mL蛋白质标准储备液、0.05 mL纯水，分别加入3 mL考马斯亮蓝标准储备液，混匀显色10 min后在波长为595 nm处测定其吸光度值，用纯水做空白对照。每个体系重复3次作为平行实验，并计算酶液中可溶性蛋白质含量。

1.2.9 数据统计与处理 采用Origin 8.0软件对Cr6+、Cu2+、Cd2+和抗生素共同作用下霉菌质量、GSH含量以及蛋白质含量进行可视化处理。通过软件SPSS 22.0分析抗生素种类、重金属种类、浓度与霉菌重量、GSH含量、蛋白质含量之间的相关关系，同时进行单变量多因素方差分析，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 重金属-抗生素复合抗性菌的筛选及鉴定

2.1.1 菌落的形态特征 霉菌24 ℃培养3 d，菌落可生长覆盖整个培养皿。在平板上，菌落初期呈白色，后期出现轮状的菌丝密实产孢区，颜色为绿色至深绿色，产孢区最终覆盖整个平板。

2.1.2 菌体特征结构 显微镜观察发现，霉菌分生孢子梗呈环状排列(见图1)。其中分生孢子主干生长呈树状分布，并呈多向产生二级孢子分枝，孢子芽部向周边延伸，呈现以2～3个分支为一组的形状，形成以根部收缩而中间膨大的趋势，分生孢子则呈球形或倒卵圆形。

2.1.3 基于ITS基因序列的系统发育分析 通过NCBI比对获得物种详细信息，并下载近缘物种序列通过ClastalW进行比对分析，然后将比对序列结果利用软件Figtree构建系统发育树，结果如图2所示。结果表明，该菌株与Trichodermakoningiopsis相似系数为99%。由图2可见，该菌株与T.koningiopsis亲缘关系相近，同为里氏木霉属(Trichoderma)。

2.2 抗生素对菌体重金属抗性的影响及其相关性

2.2.1 抗生素对菌体重金属抗性的影响 在头孢拉定、盐酸黄连素质量浓度50 mg/L下，菌体对质量浓度分别为0，5，10，50，100，200 mg/L的重金属Cr6+、Cu2+和Cd2+产生的抗性结果见图3、图4。

不同浓度重金属与头孢拉定复合胁迫抗性结果见图3。由图3a可得，重金属质量浓度在0～10 mg/L，菌体量随重金属离子浓度的增加而增加，当质量浓度为10 mg/L时，霉菌表现出最适生长速度，而随着重金属浓度的继续增加，菌体量呈显著性下降。可能原因是，重金属浓度增大导致重金属和抗生素间的交互作用而表现为先促进而后协同杀菌。相反，图3b结果表明，GSH含量与金属离子浓度成反比，即随着重金属浓度的增加GSH含量明显减少，说明重金属的存在加速了菌体的氧化损伤，从而抑制了菌体内GSH的合成。而图3c显示，重金属对蛋白质含量的影响主要表现为：低重金属浓度下其值小幅增加，然后随着重金属浓度的升高而下降，当重金属浓度达到某一临界值时，蛋白质含量趋于平稳。这可能是由于低浓度的头孢拉定在重金属的胁迫下对霉菌的抗氧化机制的抑制效果较显著[14]。因此，在重金属和抗生素的复合作用下，低浓度重金属与抗生素共存时，菌体量、GSH和蛋白质含量均较高，二者作用表现为协同抗性；高浓度时，菌体量、GSH和蛋白质含量均较低，主要表现为协同杀菌，该趋势与文献[15]的研究结果一致。

不同浓度重金属与盐酸黄连素复合胁迫抗性见图4。由4a可得，当重金属质量浓度在0～10 mg/L时，菌体生长随金属离子浓度的微量增加呈正相关；当重金属离子质量浓度超过10 mg/L时，菌体生长随金属离子浓度的微量增加呈负相关。这种变化趋势与头孢-金属复合影响的变化趋势一致，即当质量浓度达到10 mg/L时，霉菌出现最适生长速度。图4b结果表明，GSH含量随重金属类型的不同而呈现不同变化趋势，其中，GSH含量随Cu2+浓度的升高而下降，GSH随Cd2+浓度的增加呈现先增加后下降的趋势，当 Cd2+浓度为50 mg/L时，GSH含量最高可达12.454 mg/g，GSH含量随Cr6+浓度增加而变化不明显，整体趋于稳定状态。这些变化趋势与文献[16-17]的研究结果相吻合。图4c结果显示，在盐酸黄连素胁迫下，3种重金属离子对蛋白质含量的影响具有相同趋势，即表现出溶液中蛋白质含量整体变化不大趋于平稳的状态，说明重金属离子与盐酸黄连素复合作用对蛋白质含量的影响比菌体、GSH的小。

结合图3与图4可以发现，在不同抗生素胁迫作用下相同浓度相同种类的重金属体系中，木霉菌菌体量、GSH和蛋白质含量均呈现不同的变化特征。对菌体量而言，Cr6+与盐酸黄连素复合作用使得菌体量变化梯度更大，说明其复合效应较Cr6+与头孢拉定的大。相反，Cu2+与头孢拉定复合作用导致的菌体量变化显著，因此其复合效应比Cu2+与盐酸黄连素的大，说明不同抗生素与同类重金属复合作用对菌体量影响不尽相同。同样的现象也出现在GSH中，其中盐酸黄连素胁迫下，Cr6+、Cu2+对GSH含量影响不明显，不同浓度Cd2+对GSH含量的影响较显著。而头孢拉定胁迫下，不同浓度不同种类重金属对GSH含量的影响均相当显著。而对于蛋白质而言，其中盐酸黄连素胁迫下，Cr6+、Cd2+对蛋白质含量影响不明显，不同浓度Cu2+对蛋白质含量的影响较显著；而头孢拉定胁迫下，不同浓度不同种类重金属对蛋白质含量的影响不明显。

2.2.2 重金属种类和浓度与抗生素抗性的相关性分析 为了进一步探究重金属种类、浓度、抗生素种类以及二者复合作用对于抗生素抗性的影响效应，将重金属和抗生素对微生物复合作用的菌体量、GSH及蛋白质含量进行方差分析，结果见表1～表3。

表1 霉菌菌体量的主效应方差分析

表2 GSH含量的主效应方差分析

表3 蛋白质含量的主效应方差分析

由表1可以看出，对于霉菌菌体量而言，重金属种类影响效应最小，其次为重金属浓度，抗生素种类影响最显著(F=5.988,P=0.022<0.05)，重金属与抗生素的复合作用对菌体量的影响效应不大。由表2可知，对于霉菌的GSH含量而言，抗生素种类影响效应最小，其次是重金属浓度，而重金属种类有较大显著的影响(F=10.755,P=0<0.05)。由表3可以看出，对于霉菌的蛋白质含量而言，重金属种类有极显著的影响(F=9.071,P=0.001<0.05)，并且，重金属种类+抗生素种类这种交叉污染的效应对于蛋白质含量也有较显著的影响(F=21.494,P=0<0.05)，说明重金属和抗生素存在交互作用，即重金属胁迫霉菌的抗生素抗性有较为明显影响。自然环境中，多数情况是污染物之间都以混合物状态存在，因此复合污染在一定程度上影响了微生物的生长，同时也加剧诱导微生物抗性基因的出现[18]。相对于单一(抗生素或重金属)的污染情况而言，当两者以不同浓度在环境中混合时，其复合污染作用可能会发生显著性改变。这同文献[19-20]等在探究大肠杆菌经复合处理后的MIC增大幅度变小的结论相一致。

综合重金属变量和抗生素变量分析显示，两者皆是影响霉菌生长、GSH以及蛋白质含量的重要因素，本研究利用不同重金属和不同抗生素胁迫实验证明两者存在交互作用，即重金属胁迫霉菌的抗生素抗性具有显著性影响。

3 结论

1) ITS分子鉴定和形态学分析结果表明，LJM-001菌株隶属于Trichodermakoningiopsis。系统发育进化分析结果可得，该菌株同T.koningiopsis以及T.intricatu亲缘关系相近，同为里氏木霉属。

2)重金属与抗生素复合污染下，当重金属的质量浓度较低时(0～50 mg/L)，处于协同抗性；当重金属的质量浓度较高时(100～200 mg/L)，则表现为协同杀菌。

3)对重金属-抗生素复合抗性相关性分析表明，抗生素种类+重金属浓度复合效应对GSH含量影响显著，重金属种类+抗生素种类复合效应对于蛋白质含量及菌体量有较显著的影响。