循环外泌体介导的lncRNA HOXA11-AS通过上调SOX4促进血管内皮细胞增殖

王平，孟立平，刘龙斌，彭放

1.绍兴市人民医院（浙江大学绍兴医院） 心内科，浙江 绍兴 312000；2.绍兴文理学院附属医院（绍兴市立医院） 心内科，浙江 绍兴 312000

冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）是严重危害人类生命健康的一种疾病，经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前CHD的主要治疗手段，但是冠脉支架植入术后支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）一直是心内科介入医师所面临的一个非常棘手的问题。

血管内皮细胞是一层连续覆盖于整个血管腔表面的扁平细胞，是血管基底膜的重要组成部分，是血管壁与血液间的分界细胞。内皮细胞衬托在血管内壁，具有许多重要的生理功能。完整的内膜可以减少血栓的形成，减少平滑肌细胞的激活从而抑制ISR的形成。最近多项大规模临床研究结果都显示，雷帕霉素洗脱支架相比于其他的药物洗脱支架，其支架内血栓形成的风险增加，有学者怀疑这可能跟雷帕霉素引起内皮细胞损伤有关[4]，并通过基础研究证实雷帕霉素可以影响内皮细胞膜的结构，增加血小板和血栓黏附在内皮细胞上[5]。GUO等[6]研究结果显示雷帕霉素在抑制血管平滑肌细胞增殖的同时，也会抑制血管内皮细胞增殖，甚至引起血管内皮细胞的凋亡，从而破坏支架表面血管内膜形成，增加支架内血栓风险。这些研究结果提示在应用雷帕霉素药物洗脱支架的同时，使用血管内皮细胞保护性药物，可以减少支架内血栓的形成，降低ISR的发生率。

在本研究中，我们通过随访雷帕霉素支架术后患者，根据复查造影结果确认是否发生ISR，收集患者血浆并提取外泌体，用患者血浆外泌体干预经雷帕霉素诱导的内皮细胞增殖抑制模型，观察循环外泌体对内皮细胞的保护作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 内皮细胞和主要试剂 本实验中采用的人脐静脉血管内皮细胞系（HUVEC-12细胞）购自上海博湖细胞公司。胎牛血清及RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；MTT细胞增殖检测试剂盒购自美国Sigama公司；HOXA11-AS引物由上海吉凯生物科技公司合成，pHOXA11-AS及其相应对照物购自上海吉凯生物科技公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂购自大连TaKaRa公司；CD63、CD9、PCNA、Ki-67、SOX4抗体均购自美国Sant Cruz公司，Western blot相关试剂购自苏州碧云天生物科技公司。

1.2 实验分组及干预 细胞实验首先探索循环外泌体对内皮细胞增殖能力的影响，使用雷帕霉素制作内皮细胞增殖抑制模型，将细胞分为对照组、雷帕霉素组（使用雷帕霉素干预）、雷帕霉素+对照外泌体组（在雷帕霉素干预的基础上，加入对照组患者血浆外泌体）、雷帕霉素+ISR外泌体组（在雷帕霉素干预的基础上，加入ISR组患者血浆外泌体）。之后探索lncRNA HOXA11-AS对内皮细胞增殖能力的影响，使用雷帕霉素制作内皮细胞增殖抑制模型，将细胞分为雷帕霉素组（使用雷帕霉素干预），雷帕霉素+pHOXA11-AS（在雷帕霉素干预的基础上，加入pHOXA11-AS），雷帕霉素+pNS组（在雷帕霉素干预的基础上，加入空质粒）。

1.3 血浆外泌体的提取及鉴定 收集随访2018年6月至2020年6月绍兴市人民医院及绍兴市立医院收治的单支血管病变并植入1枚雷帕霉素支架的患者共426例，有随访造影结果的231例，根据是否发生ISR，将患者分为对照组（199例）和ISR组（32例），两组患者基本临床资料及病变特征见表1。收集两组患者的血液，离心获得血浆后马上用美国Life公司的Invitrogen外泌体提取试剂盒提取血浆中的外泌体，并在-80 ℃冰箱保存。本研究中所有患者均签署知情同意书，并由绍兴市人民医院医学伦理委员会批准通过。将所提取的外泌体先后经2.5%戊二醛、1%锇酸后固定，再经脱水，环氧树脂浸透包埋，制成60 nm超薄切片，经铀、铅双重染色，在HITACH500透射电镜（日本日立公司）上观察血浆外泌体的形态。血浆外泌体浓度和大小分布的测试使用q Nano（S/N 601A 1405 0338）和纳米孔NP100（A38350）。

表1 两组患者基本临床资料及病变特征

1.4 Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9和细胞增殖相关蛋白PCNA、Ki67、SOX4的表达情况提取外泌体，加入500 μL蛋白裂解液离心去上清液，用BCA法检测蛋白浓度。加样，经电泳蛋白分离和转膜，于5%脱脂奶粉封闭30 min。一抗孵育，4 ℃过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗常温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝胶成像系统显色曝光，经Quantity One进行灰度测量分析。每组实验重复3次。

1.5 MTT实验测细胞增殖能力 取4～7代细胞，胰酶消化后以每孔6×103个接种于96孔板中。细胞贴壁后，饥饿24 h使细胞同步化。各组细胞加入相应的循环外泌体或者pHOXA11-AS等干预因素，每组设3个复孔，2个空白对照孔。细胞在37 ℃、5% CO2孵箱培养6、12、24、48 h后，每孔加入20 μL MTT液，继续孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，96孔板震荡10 min，在490 nm波长处用酶标仪测定各孔OD值。最后以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.6 RT-PCR检测外泌体中lncRNA HOXA11-AS的表达水平 将提取的循环外泌体送至杭州联川生物技术有限公司检测进行非编码RNA芯片分析，得到表达差异的非编码RNA。TRIzol法提取各组细胞中的总RNA，按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行目的基因的扩增。lncRNA HOXA11-AS引物上游：5’-TGCCAAGTTGTACTTAC TACGTC-3’，下游：5’-GTTGGAGGAGTAGGAGTATGTA-3’；以β-actin作为内参，引物上游：5’-GCACCACACCTTCT ACAATGAGC-3’，下游：5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA C-3’。反应条件：预变性95 ℃，10 min，变性95 ℃，15 s，退火60 ℃ 60 s，40个循环，各设置3个重复孔，结果以2-△△Ct方法分析。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS.20.0和GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析。计数资料用频数表示，组间比较采用χ2检验。计量数据以±s表示，两组均数间比较用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆外泌体分离及鉴定 提取两组患者的血浆外泌体后，电镜结果显示外泌体呈现典型的茶托样结构（见图1A）；q Nano分析结果显示所提取的外泌体主要集中在20～100 nm（见图1B）；Western blot结果显示，相比于血清，我们所提取的外泌体中CD63、CD9这两个外泌体标志蛋白均有明显的表达（见图1C）。上述结果表明本实验成功的提取了患者血浆中的外泌体。

图1 血浆外泌体的鉴定

2.2 外泌体抑制内皮细胞增殖 用所提取的ISR患者和对照组患者的血浆外泌体，分别干预经雷帕霉素诱导的血管内皮细胞。荧光显微镜下显示两组患者中提取的血浆外泌体都可以进入细胞，将外泌体中的物质带入内皮细胞中（见图2A）。MTT结果显示，相比于对照组，雷帕霉素组细胞增殖能力减弱（P＜0.05）；相比于雷帕霉素组，对照组外泌体干预后内皮细胞增殖能力增加（P＜0.05）；而ISR组外泌体无此作用（见图2B）；Western blot结果显示，相比于对照组，雷帕霉素组细胞中PCNA和ki-67表达减少（P＜0.05）；相比于雷帕霉素组，对照组外泌体干预后内皮细胞中PCNA和ki-67表达增加（P＜0.05），见图2C-D。

2.3 外泌体中差异表达非编码RNA的筛选 非编码RNA芯片分析结果显示，与对照组比，ISR组患者血浆外泌体中多种lncRNA的表达发生了变化，其中最明显的是lncRNA HOXA11-AS（见图3A）。为了进一步验证这一芯片检测结果，采用RT-PCR法检测了31例对照患者（从199例中随机抽取）和32例ISR患者血浆外泌体中lncRNA HOXA11-AS的表达情况，发现相比于对照组，ISR患者血浆外泌体中lncRNA HOXA11-AS的表达明显减少（t=2.71，P＜0.05），见图3B。

图2 对照组患者血浆外泌体降低雷帕霉素对内皮细胞增殖的抑制作用

2.4 lncRNA HOXA11-AS促进内皮细胞增殖 用lncRNA HOXA11-AS干预经雷帕霉素诱导的内皮细胞增殖抑制模型，MTT结果显示，相比于雷帕霉素组，雷帕霉素+pHOXA11-AS组细胞增殖能力增强（P＜0.05）；Western blot结果显示，相比于雷帕霉素组，雷帕霉素+pHOXA11-AS组细胞中PCNA、Ki-67表达增加（P＜0.05），同时，SOX4的表达增加（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

外泌体是由细胞分泌的具有脂质双分子层膜结构的生物活性微泡，其直径一般为40～100 nm，高表达CD63、CD81、TSG101等分子。血液中的外泌体不仅参与了多种疾病的进展，在维持机体正常的生理平衡过程中也有重要作用。RIBEIRO-RODRIGUES等[7]研究发现心肌细胞分泌的外泌体具有保护缺血心肌，促进新生血管形成的作用。GALLET等[8]研究发现部分心梗患者血浆中提取的外泌体具有减少心脏瘢痕，阻止心肌重构的作用。本研究提取了植入雷帕霉素药物洗脱支架后发生ISR和没有发生ISR的患者血浆外泌体，并用这些外泌体干预经雷帕霉素处理之后的内皮细胞，发现相较于ISR组，对照组干预后内皮细胞的增殖能力明显增强。这一结果提示ISR患者和无ISR患者血浆外泌体有差异，并且血浆外泌体可能是通过影响血管内皮细胞的增殖能力而参与了ISR的形成。

外泌体主要是通过包裹在里面的蛋白质、microRNA和lncRNA等小分子发挥生物学功能。 lncRNA虽然不直接参与编码蛋白质，但是其参与调控机体生命进程中一系列重要过程，包括生长发育、器官形成、骨髓造血、细胞凋亡、细胞增殖等[9]。 在心血管领域中，lncRNA在CHD、高血压、心脏功能不全等疾病的发生发展中都具有重要的调控作用。BALLANTYNE等[9]研究发现lnc-SMILR在动脉粥样硬化患者斑块和血浆中的表达增加，并可以通过促进VSMCs的增殖和迁移从而加速粥样斑块的进展。基于这些研究结果，我们猜测在ISR过程中血浆外泌体可能也是通过其中的lncRNA发挥作用。本研究通过基因芯片技术检测了雷帕霉素药物洗脱支架植入术后发生ISR以及没有发生ISR患者血浆外泌体中lncRNA的表达情况，发现7种lncRNA在两组之间表达差异明显，ISR组中MAGI2-AS3、lincRNAp21、LOC645166表达增加，ZNF37BP、LOC389906、LINC00189、lncRNA HOXA11-AS表达减少。为了进一步筛选，我们用RT-PCR法检测了目前已经收集了的雷帕霉素药物洗脱支架植入后的32例ISR以及31例对照组患者血浆中上述lncRNA的表达情况，发现lnc HOXA11-AS在ISR患者血浆外泌体中表达减少。HOXALL-AS是一个新近被发现并研究的lncRNA，关于此lncRNA的报道主要集中在肿瘤领域。有研 究[13]发现HOXA11-AS与胶质瘤的细胞周期相关，能反映肿瘤的分级，并导致不良的预后。而有研究则提出HOXA11-AS可能通过作用于HOXA11-AS基因来参与宫颈癌的发生[14]。国外的研究报道了HOXA11-AS的表达差异与人卵巢癌及肺腺癌的转移、侵袭、分期及预后等因素相关，并提出HOXA11-AS对卵巢癌的抑制并非是通过对HOXA11基因的调控来实现的[15-16]。有研究显示HOXA11-AS可以通过调控miR-140-5p、LATS1、miR-124、PADI2等的表达从而促进肿瘤细胞的增殖[17-21]。上述研究均提示HOXA11-AS具有促进细胞增殖的作用，与上述研究结果相符，本研究结果显示HOXA11-AS可缓解雷帕霉素对内皮细胞增殖能力的抑制作用。文献资料表明HOXA11-AS可以促进多种肿瘤细胞的增殖[17-21]，目前尚未见HOXA11-AS对细胞的抑制作用的相关报道，可能HOXA11-AS是一个促进细胞增殖的分子，所以在促进内皮细胞增殖的同时，同样也会促进平滑肌细胞的增殖，从而降低雷帕霉素对平滑肌细胞的抑制作用，成为促进ISR进展的一个因子，我们将在后续研究中进一步验证HOXA11-AS对平滑肌细胞增殖能力的作用。

图3 ISR患者血浆外泌体中lncRNA HOXA11-AS的表达明显减少

SOX4基因属于SOX C亚族，主要在胚胎发育过程中的心脏、中枢神经系统、胸腺高表达。此外，SOX4还在一些干细胞和祖细胞中高表达，对干细胞的稳定和分化具有重要的调控作用。研究表明SOX4基因突变、缺失或者过表达不仅会引起先天性疾病，还与肿瘤、心脑血管疾病等的发生发展密切相关。最近的研究还发现SOX4基因的表达与多种肿瘤患者预后相关，并预测SOX4可以作为肿瘤治疗的一个靶向位点[22-23]。此外，靶向抑制SOX4的表达可以降低细胞的增殖能力[24-25]。为了进一步探究血浆外泌体抗ISR效应的机制以及HOXA11-AS在其中的作用，我们通过靶基因预测软件发现lncRNA HOXA11-AS与SOX4具有可能结合的相应位点，并通过Western blot实验证实lncRNA HOXA11-AS可以促进内皮细胞中SOX4的表达，所以我们推测，血浆外泌体中的lncRNA HOXA11-AS可能是通过上调内皮细胞中SOX4的表达，从而增加内皮细胞的增殖能力。

本研究成功收集并分离出ISR及对照组患者血浆外泌体，发现对照组患者外泌体可以降低雷帕霉素对内皮细胞增殖的抑制作用，并通过基因芯片及RT-PCR筛选出两组外泌体之间lncRNA HOXA11-AS表达差异。细胞实验进一步证实lncRNA HOXA11-AS可以降低雷帕霉素对内皮细胞增殖的抑制作用，并同时促进SOX4表达。根据上述结果，我们推测血浆外泌体中的lncRNA HOXA11-AS可能是通过上调内皮细胞中SOX4的表达，从而增加内皮细胞的增殖能力。

A：MTT法测细胞增殖能力；B：Western blot检测增殖标志蛋白PCNA和Ki-67的表达情况；C：Western blot检测SOX4的表达情况。与雷帕霉素组比：aP＜0.05 图4 lncRNA HOXA11-AS促进内皮细胞增殖