Wnt/β-catenin信号通路及骨髓间充质干细胞源性外泌体在温和灸联合骨髓间充质干细胞移植促进大鼠肛门括约肌修复中的作用*

金文琪，李 鹏，周蒙恩，朱 影，郭修田

（上海中医药大学附属市中医医院肛肠外科，上海 200071）

肛门失禁（anal incontinence）是指有机体由于各种原因引起的不能随意液体或固体粪便排出，严重影响患者生活质量的一种难治性疾病[1-3]。导致肛门失禁的原因可分为神经源性损伤和肌源性损伤，肌源性损伤在日常生活中更为常见，肛门括约肌损伤为其中最普遍的一种[4]。生理学认为肛门括约肌由内外两层环形的括约肌构成，两者共同协调维持肛管的闭合功能[5]。属不随意肌的内括约肌产生的压力占肛管静息压的70%～80%，以维持肛管在静息状态的闭合功能，属随意肌的外括约肌可在外界条件不允许排便的情况下收缩以闭合肛门[6]。因此，任何一种括约肌的损伤均会导致大便失禁。

针对肛门括约肌损伤，间充质干细胞移植可能是修复括约肌损伤最有前景的方法之一[7-9]。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）为成体干细胞亚组，其不仅可以分化为内皮细胞、上皮细胞、角化细胞、成纤维样细胞等，还可通过旁分泌机制分泌一些生物活性因子或外泌体以促进内源性细胞的增殖与迁移，从而协同促进创面血管新生，上皮再生与创面重塑，最终达到创面修复的目的[10-13]。近期研究表明，MSC旁分泌是其发挥作用的重要方式[14-18]。其中最受关注的是可溶性蛋白分泌和细胞外膜泡（EVS），MSC可以通过释放胞外膜泡（EVS）影响局部微环境中其它细胞的活动[19-21]。外泌体属于细胞外泌微泡的亚型，其膜性结构主要起源于细胞内膜，直径为介于30～150 nm，广泛存在于几乎所有组织，细胞间隙和体液中，在细胞与细胞间信息交流和机制调控中启到重要作用。目前研究发现，外泌体主要通过其膜上和膜内物质发挥作用，间充质干细胞来源的外泌体在关节损伤修复，组织再生，创伤修复等方面发挥关键作用[22]。BMSC作为MSC中众多分类中的一种，因其分化程度较低，更接近原始干细胞而受到广泛青睐。

温和灸属于艾卷灸之悬起灸的一种，是将艾条燃着的一端与施灸部位的皮肤保持1寸左右距离，使患者有温热而无灼痛的一种方法[23]。目前研究发现，温和炙可以促进混合痔术后的组织修复，缓解术后疼痛和肛门水肿，促进创面愈合[24-25]。在大鼠肛门括约肌损伤模型中，笔者发现温和炙可以促进间充质干细胞的归巢效应进而介导肛门括约肌的修复，并发现在移植间充值干细胞来源的外泌体后，相比于单纯手术组，损伤组织中的Wnt信号显著激活，从而明确了间充质干细胞通过分泌外泌体促进了肌细胞的增殖和肛门括约肌组织的修复。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂 健康Srague-Dawley雌性大鼠16只，年龄约12周，体质量200～250 g，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供 [许可证号：SCXK（沪）2012-0002]，饲养温度 25°C，湿度 50%。大鼠适应性喂养1周后用于本实验，在整个实验过程中严格遵守上海中医药大学附属市中医医院动物伦理委员会标准条例。艾条购自上海市针灸经络研究生经营部，为福元牌7 mm无烟艾条。Real-Time PCR材料：引物合成购自上海生工生物工程公司；RNA提取液 TRIzol购自 Invitrogen公司；PrimeScript RT Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒，SYBR Premix Ex Tag II（Tli RNaseH Plus） 试剂盒购自TaKaRa公司。SD大鼠间充质干细胞和小鼠间充质干细胞培养与鉴定材料：胰蛋白酶，胎牛血清购自Gibico公司；BD Falcon细胞筛，抗CD34、CD45单克隆抗体购自BD公司。免疫印迹材料：兔抗Wnt4，兔抗Wnt5a，兔抗Wnt5b，兔抗DKK3购买自 Abcam，细胞裂解液RIPA购买自Solarbio。外泌体抽提试剂盒exoEasy Maxi Kit购自UL。

1.2 实验分组与模型建立 将16只SD大鼠随机等分为温和炙组，干细胞组，温和炙联合干细胞组、生理盐水组，每组4只。肛周备皮后所有大鼠均采用Zutshi提出的大鼠肛门括约肌复合体损伤模型：腹腔内注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，在解剖显微镜下进行后位纵行切除3 mm×1 mm×1 mm肛门括约肌复合体。术后用布比卡因（0.5 mg/kg）注射镇痛，每天2次，共1 d。

1.3 BMSC分离、培养及鉴定 处死大鼠后取股骨，0.01 mol/L PBS冲洗干净后采用细胞滤膜筛选细胞，加入1 mL 0.25%胰酶置于37℃消化；显微镜下观察细胞出现收缩时弃去胰酶，更换1 mL DMEM-10%FBS培养基吹打细胞20次，按1∶2比例传代，加入新鲜DMEM-10%FBS培养基置于37℃二氧化碳培养箱中培养；200×g离心细胞悬液5 min，获取沉淀以适当体积0.01 mol/L PBS缓冲液重悬至移植所需的细胞密度。流式细胞仪采用阴性选择法进行鉴定，取第三代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4℃离心，1 000 r/min，5 min，用 1× PBS（含 1%BSA）清洗细胞3次，计数细胞，加入单克隆抗体CD34、CD45。同时每管样品设立同型阴性对照。

1.4 治疗方式 温和灸治疗：在距肛门约5 cm处进行行温和灸，每日1次，每次30 min。干细胞治疗：采用尾静脉注射干细胞0.1 mL PBS/次（含107个干细胞），每日1次。生理盐水注射：采用尾静脉注射0.1 mL生理盐水，每日1次。所有大鼠均连续进行14 d。

1.5 检测括约肌组织Wnt4、Wnt5a、Wnt5b表达 分别采用Western blot、qPCR检测蛋白表达。Western blot步骤：提取组织蛋白，配置SDS-PAGE膜，转膜，TBST漂洗 1 h，5%BSA封闭 2 h，加入一抗（1 μL兔抗Wnt4，1 μL 兔抗 Wnt5a，1 μL 兔抗 Wnt5b），4 ℃过夜，TBST漂洗1 h，二抗孵育封，TBST漂洗1 h，显影。qPCR步骤：采用按试剂盒说明书用q PCR方法检测括约肌细胞内Wnt4、Wnt5a、Wnt5b mRNA表达。每个样品的定量进行3次重复，相对mRNA水平用actin为内参采用－△△CT值算法。

1.6 BMSC源性外泌体分离 待培养的BMSC细胞融合度接近70%，去培养基，无血清培养48 h，收集上清，利用外泌体抽提试剂盒exoEasy Maxi Kit（QIAGEN）进行分离提取，提取后电镜鉴定，CD63/CD81检测，BCA试剂盒定量。

1.7 成肌细胞C2C12与外泌体共培养及功能检测将 C2C12 细胞与 5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 的外泌体共培养48 h，利用CCK8和EDU试剂盒（Ribobio）检测细胞增殖，利用流式细胞仪检测C2C12的细胞周期和凋亡。

2 结果

2.1 BMSC生长与形态特征 采用倒置相差显微镜观察分离的细胞，结果发现其符合大鼠骨髓间充质干细胞的形态特征：细胞贴壁生长，呈长梭形；早起呈多个散在的细胞集落，此为均匀分布的BMSC簇状增殖灶，细胞排列呈似漩涡状；生长后期细胞增殖良好，排列紧密（图 1）。

图1 间充质干细胞形态特征

2.2 Western blot和 qPCR 检测 Wnt4、Wnt5A、Wnt5B蛋白表达 Wnt/β-catenin信号通路在组织损伤与修复机制中作用显著。在前期温和灸联合间充质干细胞移植可协同促进大鼠损伤肛门括约肌结构和功能恢复的基础上，为进一步探索此种协同修复效果是否与Wnt/β-catenin信号通路相关，在治疗14 d后剥离各组大鼠肛门括约肌，进行qPCR和Western blot检测各组肛门括约肌组织中wnt蛋白的表达差异，结果显示温和灸联合 BMSCs移植可促进 Wnt4、Wnt5A、Wnt5B高表达（图2A，B）。因此，温和灸联合间充质干细胞可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而促进对损伤肛门括约肌组织的修复作用。

图2 A.qPCR分析各组样本中WNT4,WNT5A,WNT5B RNA表达B.Western blot分析各组样本中WNT4,WNT5A,WNT5B蛋白的表达

2.3 BMSC源性外泌体鉴定 为分析及验证所抽提外泌体质量及性状，采用扫描电镜分析BMSC源性外泌体形态及直径，结果显示BMSC源性外泌体粒径分布在80～140 nm，符合外泌体粒径特征（图3A）；Western blot检测外泌体表面标记蛋白CD63和CD81呈显著富集；符合外泌体膜表面蛋白标记特征（图3B）。根据上述结果可证实富集到的是骨髓间充质干细胞源性外泌体。

图3 A.扫描电镜分析外泌体形态及粒径;B.Western blot分析间充质干细胞和外泌体中CD63和CD81表达

2.4 成肌细胞C2C12与外泌体共培养及功能检测EDU结果显示在25 μg/mL的BMSC源性外泌体作用下C2C12细胞处于细胞分裂期的数量显著上升（图4A，B）。采用CCK8检测BMSC源性外泌体对小鼠成肌细胞C2C12增殖的作用，结果显示BMSC源性外泌体可显著促进C2C12细胞增殖，增殖效果随着外泌体浓度增加而逐步提升（图4 C）。为进一步明确作用机制，将BMSC源性外泌体与C2C12细胞共培养，Western blot结果显示可显著抑制Cleaved Caspase3和BAX表达，并显著上调BCL2表达（图4 D）。证实BMSC源性外泌体可促进C2C12成肌细胞的增殖并抑制其凋亡。为进一步分析BMSC源性外泌体对C2C12细胞周期及凋亡的影响，流式细胞术检测发现BMSC源性外泌体可显著促进C2C12细胞S期和G2期（图5A，B）。与对照组相比，BMSC源性外泌体可以显著抑制C2C12细胞凋亡（图5C-D）。因此，间充质干细胞源性外泌体可能通过调控C2C12细胞周期以促进增殖并抑制其凋亡作用。

图4 A-B.EDU检测间充质干细胞来源外泌体对C2C12细胞增殖的促进作用;C.CCK8分析不同浓度充质干细胞来源外泌体对C2C12细胞增殖的促进作用;D.Western blot分析间充质来源外泌体对凋亡抑制蛋白Bcl-2,凋亡促进蛋白BAX和Cleaved Caspase3的表达影响

图5 A-B.间充质干细胞来源外泌体对C2C12细胞周期的影响；C-D.间充质干细胞来源外泌体对C2C12细胞凋亡的影响

3 讨论

干细胞具有增殖及多向分化潜能，强大的旁分泌机制，在组织工程学领域研究广泛。许多研究证实BMSC移植可促进不同组织的修复与再生，从而改善损伤组织的功能[26-30]。随着越来越多干细胞修复组织的基础实验的涌现，许多结直肠外科医师也将其应用于损伤肛门括约肌的修复中，采用不同的大鼠肛门括约肌损伤模型，不同的细胞移植方式，企图寻找一种最适于括约肌修复的移植方法。Salccedo等[31]首次建立大鼠损伤肛门括约肌模型，将BMSC移植后检测大鼠肛门括约肌组织修复情况，发现干细胞移植可显著促进大鼠损伤的肛门括约肌组织结构的恢复。Trébol等[32]独创一种最新的大鼠肛门括约肌损伤模型，并采用与之前干细胞移植不同的方法——生物缝合技术，也发现生物缝合技术能够安全有效的促进肛门括约肌的修复。Bisson等[33]将同系的成肌细胞注射在冷冻损伤的大鼠括约肌内及损伤边缘，发现成肌细胞可分化为成熟肌纤维，在60 d后肛压可显著增高并与正常组无显著差异，并发现注射在创面边缘与创面中心效果相同。干细胞移植可作为一种微创的治疗方式用于损伤肛门括约肌组织的修复。

温和灸不仅在临床研究中疗效显著，在很多基础实验也表现出极大的优势。基础实验研究证实在大鼠慢性难愈性创面的局部及双侧肾俞、足三里施以温和灸治疗后，创面修复初期和中期可增加肉芽组织中VEGF的表达，从而促进血管新生，改善创面血流，在修复后期可抑制血管新生，缩短创面愈合时间，提高愈合质量[34]。在创面修复的初期与中期，温和灸还可提高创面的巨噬细胞数，平衡胶原产生与降解，调节创面Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的比例，防止瘢痕形成，提高创面愈合质量[35]。温和灸可显著改善大鼠肛瘘术后感染性创面局部微循环，有效调控创面VEGF及CD34的表达，加速创面愈合[36]。因此，温和灸以其“以温促通”的功效可促进创面修复。因此，前期研究将温和灸与骨髓间充质干细胞移植联合应用于大鼠损伤肛门括约肌，发现两者具有协同作用，可显著促进大鼠肛门括约肌组织结构和功能的统一恢复[37]。

Wnt/β-catenin信号通路在组织的稳态及发生发展过程中至关重要[38]，Wnt蛋白在胚胎发育及成体组织中是一类可调节干细胞自我更新、分化及细胞间交流的分泌型蛋白，它可促进上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等创面细胞的增殖、凋亡、分化等多种生物学过程，许多关于干细胞对创面修复的研究认为这种恢复效果均是通过不同的Wnt蛋白以激活Wnt经典通路从而发挥作用的[39-40]。成肌细胞在缺乏β-catenin时会导致延迟分化，而在具有持续活化的β-catenin时可停止生长并产生分化，证实Wnt/β-catenin信号通路在肌源性干细胞向骨骼肌分化过程中起重要作用[41]。骨髓间充质干细胞已被证实可促进组织修复及再生，但是目前仍不清楚它是如何调节下游的Wnt信号的。不仅如此，研究证实大量wnt配体在组织急性损伤后高表达，包括 wnt3a、wnt4、wnt5a、wnt10a、wnt11[42]。

前期研究证实温和灸可促进间充质干细胞的归巢，温和灸联合骨髓间充质干细胞移植对括约肌结构和功能的恢复具有协同作用。但这种联合方式的疗效通过激活何种信号通路发挥疗效仍未可知。因此，本文主要探索温和灸联合骨髓间充质干细胞移植是否通过调节 3 种 Wnt相关蛋白（Wnt4、Wnt5A、Wnt5B）中的一种或多种以激活Wnt/β-catenin信号通路从而发挥对大鼠损伤肛门括约肌的修复效果。创面成肌细胞为肌肉损伤修复过程中的关键细胞，为进一步明确骨髓间充质干细胞外泌体创面成肌细胞的作用，因此采用体外研究BMSC源性外泌体对成肌细胞C2C12的影响，证实可调控C2C12细胞周期，促进其增殖，抑制凋亡。

4 结论

综上所述，温和灸联合间充质干细胞移植可能通过两方面促进大鼠损伤肛门括约肌组织修复。一方面可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路以发挥修复效果，另一方面可能通过调控成肌细胞C2C12的细胞周期促进其增殖并抑制凋亡从而促进局部肌组织细胞的再生、增殖促进组织修复。