李道宏,胡爱侠,靳钰炜
河南省人民医院病理科,郑州 450000
胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,全球范围内,胃癌的发病率和病死率均较高,尤其高发于发展中国家。胃癌患者确诊时常已经处于晚期,预后较差、生存率低,因此,提高胃癌的早期诊断率,早期治疗,才能延长胃癌患者的生存期。众所周知,远处转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因,但远处转移需多种蛋白、多种基因共同参与,且需经过多个步骤才能完成,而细胞增殖、迁移和侵袭是恶性肿瘤远处转移的主要特征。胃癌细胞具有较强的侵袭和迁移能力,可促使胃癌早期即发生转移,或在转移过程中发生进一步变化,导致化疗失败,并诱导胃癌复发或发生更深层的转移。因此,明确胃癌细胞的侵袭、转移机制有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种单链小分子RNA,长度18~25 nt,在多种恶性肿瘤中发挥至关重要的作用,主要通过与靶蛋白结合调控细胞功能。肿瘤细胞的侵袭和迁移离不开上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、Dicer1等的调控。研究表明,miRNA-186在食管癌中低表达,且生物信息学分析发现,miRNA-186可能靶向调控Dicer1,但其在胃癌中的作用机制鲜有相关报道,因此,本研究通过观察miRNA-186在胃癌中作用机制,旨在为胃癌的早期诊断和靶向治疗提供参考,现报道如下。
选取2018年3月至2019年6月河南省人民医院收治的胃癌患者。纳入标准:①经胃镜和病理组织学检查确诊为胃癌;②未合并其他严重疾病。排除标准:①癌旁组织有明显的炎性细胞浸润;②合并胃溃疡、胃糜烂;③合并其他恶性肿瘤。依据纳入和排除标准,本研究共纳入40例胃癌患者,其中男22例,女18例;平均年龄(61.35±5.65)岁;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期24例,Ⅲ~Ⅳ期16例;淋巴结转移26例,无淋巴结转移14例;分化程度:低分化28例,中高分化12例。取40例胃癌患者的胃癌组织及相应的癌旁正常组织。
1.2.1 细胞、主要试剂和仪器 胃癌细胞BGC-823、正常胃黏膜上皮细胞RGM-1、共转染293FT细胞均购自中科院上海细胞研究所,pLVTHM-mimic-miRNA-186、pLVTHM-mimic-NC、miRNA-186及GAPDH引物均由上海吉玛设计合成。Anti-Dicer抗体[4A6](ab82539)、Anti-N-cadherin 抗体(ab76057)、山羊抗兔 IgG H&L(Alexa Fluor488)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠IgG H&L(ab205719)均购自美国Abcam公司,Transwell小室购自美国BD公司,Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Vector公司。SANYO MCO-15AC细胞培养箱购自美国强生公司,超净工作台购自北京六一仪器厂,5810R型高速离心机购自日本岛津公司。
1.2.2 构建稳定过表达miRNA-186细胞系 取对数生长期的细胞,胰蛋白酶消化,调整细胞浓度至1×10/L,加入至6孔板中,置于37 ℃、5% CO的培养箱中培养,细胞融合度达70%时严格按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染,分别将pLVTHM-mimic-miRNA-186和pLVTHM-mimic-NC转染至293FT细胞,转染48 h后收集慢病毒感染液,分别转染BGC-823细胞,得到过表达的BGC-823-mimics-miRNA-186细胞、阴性对照BGC-823-mimics-NC细胞。
1.2.3 定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测组织和细胞中miRNA-186的相对表达量 取胃癌组织及癌旁正常组织,正常胃黏膜上皮细胞RGM-1、胃癌细胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186及阴性对照BGC-823-mimics-NC细胞。Trizol法提取总RNA,逆转录成互补DNA(complementary DNA,cDNA),在PCR仪上进行扩增,扩增条件:95℃预变性30 s,1个循环;95℃变性5 s,60 ℃退火30 s,40个循环;95℃延伸5 s,60℃ 1 min,95℃终止,1个循环。以GAPDH作为内参,2计算miRNA-186的相对表达量。GAPDH正向引物:5'-TGCTCCTCCTCCTGCT-GCTC-3',反向引物:5'-GCAGAAGGTGGAGGTGCAGC-3';miRNA-186正向引物:5'-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3',反向引物:5'-TCTTCAGGGCTTTCTCGTTC-3'。
1.2.4 Transwell实验检测细胞侵袭能力 取40 μl的Matrigel胶用不含胎牛血清的RPMI-1640以1∶8稀释后,水化铺在Transwell小室的上室底部,取胃癌细胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和BGC-823-mimics-NC细胞消化后,采用1×磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)冲洗 2次。同时,采用无血清的RPMI-1640培养液将细胞稀释至1×10/ml,加入200 μl细胞悬液至 Transwell小室的上室,加入500 μmol含20% FBS的RPMI-1640至Transwell小室的下室,保证下层完全培养基与Transwell小室间无气泡,置入培养箱培养24 h。取出Transwell小室的上室用预冷的PBS冲洗2次,加入500 μl甲醇配制、PBS稀释的0.1%结晶紫染液进行染色,室温避光15 min,PBS漂洗去掉Transwell小室内部游离细胞,倒置晾干,置于倒置荧光显微镜下观察拍照并计数。
1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力 取胃癌细胞BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和 BGC-823-mimics-NC细胞消化后,采用无血清培养基调整细胞浓度为5×10/ml,加入至6孔板中,置于37℃、5% CO的培养箱中培养,待细胞融合度达90%时,采用10 μl白色枪头垂直划线,PBS冲洗,显微镜下拍照记为0 h,加入培养基继续温箱培养48 h拍照,然后计算细胞迁移率。
1.2.7 双荧光素酶报告基因验证miRNA-186和Dicer1
的关系 从PCR扩增http://www.targetscan.org网站得到miRNA-186和Dicer1
的靶向结合片段,然后将其插入荧光素酶载体psi-CHECK中,构建野生型质粒psi-CHECK-Dicer1-wild和突变型质粒 psi-CHECK-Dicer1-mutant,以 mimics-NC 为 对照。然后将野生型和突变型质粒分别共转染至293FT细胞,4 h后采用分光光度计检测荧光素酶活性(OD)。1.2.8 蛋白质印迹法(Western blot)检测Dicer1蛋白的相对表达量 取正常胃黏膜上皮细胞RGM-1、胃癌细胞 BGC-823、BGC-823-mimics-miRNA-186和BGC-823-mimics-NC细胞,胰蛋白酶消化,离心稀释成细胞悬液,按1×10/孔接种至6孔板中;置入5% CO、37℃培养箱3 h,采用试剂盒提取各组细胞总蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白含量。每个样本取50 μg蛋白上样,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳后,转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别加入稀释好的一抗,4℃孵育过夜。恢复至室温后,PBST充分洗膜,加入适量稀释好的HRP标记的二抗,室温振荡1 h,PBST洗膜,电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)法显色,采用Image J软件分析条带的灰度值,以GAPDH作为内参,计算Dicer1的相对表达量。
t
=36.932,P
<0.01)。胃癌细胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC中miRNA-186的相对表达量均明显低于正常胃黏膜上皮细胞RGM-1,稳定过表达BGC-823-mimics-miRNA-186细胞中miRNA-186的相对表达量明显高于胃癌细胞BGC-823、BGC-823-mimics-NC和正常胃黏膜上皮细胞RGM-1,差异均有统计学意义(P
<0.01)(表1)。表1 不同细胞中miRNA-186相对表达量的比较(±s)
P
<0.05)。细胞划痕实验结果显示,BGC-823-mimicsmiRNA-186细胞迁移率低于胃癌细胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC,差异均有统计学意义(P
<0.05)。(表 2)表2 miRNA-186对胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力的影响(±s)
P
<0.05)。(表3)表3 不同细胞N-cadherin表达情况的比较(%,±s)
P
<0.05);而对突变型psi-CHECK-Dicer1-mutant的荧光素酶活性无明显影响,差异无统计学意义(P
>0.05)。(表4)表4 miRNA-186对野生型和突变型Dicer1荧光素酶活性的影响(±s)
P
<0.01)。(表5)表5 不同细胞Dicer1蛋白相对表达量的比较(±s)
胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,全球范围内,胃癌病死率居所有恶性肿瘤的第三位。因胃癌的局部复发或远处转移导致病死患者逐年上升。中国是胃癌高发国家,严重威胁中国居民的身体健康及生活质量。胃癌的发病机制十分复杂,尽管目前的外科手术和化疗手段不断进步,但胃癌的病死率仍居高不下,患者的5年生存率远远低于30%。胃癌细胞的远处转移成为影响胃癌患者治疗成功的关键。因此,探讨与胃癌发生发展相关的分子及作用机制在胃癌的诊断和治疗中有重要意义。miRNA主要通过竞争或靶向调节信使RNA(messenger RNA,mRNA)发挥作用,能参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程。近年来,多种实体肿瘤中均发现了miRNA的异常表达,且能够通过调控癌基因来调节肿瘤细胞的生物学特性。miRNA-186作为miRNA成员,共有86个核苷酸,位于染色体lp31.1上,有研究发现,miRNA-186可靶向下调子宫内膜癌抑癌基因叉头框蛋白O1(forkhead box O1,FOXO1)的表达,从而促进肿瘤细胞的增殖;还有研究显示,miRNA-186在肿瘤上皮细胞能够下降凋亡蛋白P2X7的表达来发挥促癌作用;但也有学者研究发现,miRNA-186在原发性神经管细胞瘤中表达下调,可能发挥抑癌基因的作用;此外,研究发现,miRNA-186可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,同时抑制细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2,CDK2)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)等蛋白的表达。
本研究采用qRT-PCR法检测组织和细胞中miRNA-186的相对表达量,结果显示,胃癌组织和胃癌细胞中miRNA-186均表达下调,随后采用慢病毒转让技术构建稳定过表达miRNA-186的细胞系,从而观察其在胃癌中的作用机制。侵袭和迁移能力是肿瘤细胞的重要生物学行为,也是患者发生远处转移甚至死亡的根本原因。本研究结果显示,BGC-823-mimics-miRNA-186细胞侵袭数目较少、迁移率较低,表明miRNA-186能抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。侵袭和迁移是恶性肿瘤的基本生物学特征,涉及多种蛋白因子相互协调和共同作用,EMT是实体肿瘤发生侵袭和迁移的重要进程,可能是因为EMT主要是肿瘤细胞从肿瘤母体脱离并向周围组织转移扩散的起始。作为EMT的标志物,研究表明,N-cadherin在鼻咽癌中表达明显上调。本研究经IFA观察发现,过表达miRNA-186的BGC-823-mimics-miRNA-186细胞中N-cadherin阳性表达率低于胃癌细胞BGC-823和BGC-823-mimics-NC,提示miRNA-186能够抑制N-cadherin的表达。研究发现,肝癌细胞中Dicer1呈低表达,其主要受到miRNA-215的调控,从而促进肝癌细胞侵袭和转移;还有学者在浆液性卵巢癌动物模型中发现,Dicer1能够明显抑制卵巢癌的发生发展过程,且其水平高低与卵巢癌的进展呈明显负相关;本研究双荧光素酶报告实验证实,miRNA-186能够靶向调控Dicer1;此外,Western blot实验发现,过表达miRNA-186后,Dicer1表达明显上调,提示miRNA-186可正向调控Dicer1。
综上所述,miRNA-186通过靶向正调控Dicer1的表达,下调N-cadherin的表达,从而发挥抑制胃癌细胞侵袭和迁移的作用,但仍需进一步采用慢病毒转染技术调控Dicer1的表达,观察Dicer1与EMT的关系。