促进镉吸收积累的植物根际促生菌的筛选及其对一年生黑麦草的影响

吴慧丽，田薇，纪燕玲，娄来清，蔡庆生

（南京农业大学生命科学学院，江苏南京210095）

当今世界经济快速发展，工业化进程加快，土壤重金属主要通过废水处理、农药喷洒、采矿等污染各种生态系统，通过食物链进入人体，进而危害健康。根据全国土壤污染状况调查公报［1］，镉的点位超标率达7.0%，位于无机污染物之首。镉（cadmium，Cd）是“五毒”元素（镉、铅、汞、铜、砷）之一，是一种非必需元素，具有迁移速度快、毒性强、难以降解等特点。它能够抑制植物生长，影响养分吸收和内环境平衡。镉进入人体可能会对肺、肾脏、睾丸、胎盘和骨骼等各种器官造成生理损害［2］。最先起源于日本富山县的镉中毒事件，其主要的症状表现为骨软化、骨折及骨质疏松［3］。

重金属污染土壤亟待修复。在众多修复方式中，植物−微生物联合修复因其低成本和高效率而备受关注。它是将植物和微生物结合起来，发挥各自的优势，直接或间接地吸收、转化土壤中的重金属元素。微生物可以活化或钝化土壤中的重金属，增加或减少植物对重金属的吸收。在根际，根系分泌出营养丰富的分泌物，这些分泌物对促进微生物的生长至关重要。反之，微生物提供了一个理想的土壤环境，植物根系可以从土壤中吸收水分和矿物质。然而，大多数超积累植物生长速度缓慢［4］、生物量较小、修复范围和效率有限［5］；而许多微生物不仅能够促进植物生长，其本身和代谢物可通过不同机制对土壤进行修复。因此，将生物量大的植物与微生物结合起来，两者相互作用，可以提高重金属污染土壤的修复效率。

植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指生长在植物根际土壤中，能够促进植物生长、提高植物抗性的一类有益细菌［6］。PGPR 通过分泌生长素、溶磷、产1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）脱氨酶和铁载体直接或间接地促进植物生长［7］。已有报道表明，接种PGPR 能够增加水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、萝卜（Raphanus sativus）、甜椒（Capsicum annuumvar.grossum）等的生物量，提高植物重金属耐性［8−10］。多花黑麦草（Lolium multiflorum）又名一年生黑麦草，根系发达、生物量大、抗生物胁迫、易于栽培，适应性广，可用于植物修复和生物乙醇生产，被认为是良好植被恢复物种［11］，在我国长江中下游及其以南地区有较大面积的栽培和利用［12］。之前的研究表明，黑麦草能够耐受镉胁迫［13］，且黑麦草−水稻轮作系统能够移除稻田中的镉污染［14］。

本研究从镉污染地区的植物根际分离出PGPR 菌株，将其接种到一年生黑麦草上，测定黑麦草生物量及体内镉含量，期望达到修复镉污染土壤的目的。

1 材料与方法

1.1 土壤样品的采集

根际土壤取自湖南省郴州市桂阳县官溪村（25°43′N，112°45′E，海拔202.3 m）的重金属污染区，土壤pH 为6.1，镉浓度为 1.73～2.71 mg·kg−1，平均值为 2.21 mg·kg−1，超过国家标准［15］（水田，5.5＜pH≤6.5，0.4 mg·kg−1）近6 倍。将植物根际土壤取出，用保鲜膜将土壤包裹住，避免水分蒸发。尽快送到实验室内进行下一步处理。

1.2 耐镉菌株的分离及鉴定

1.2.1 耐镉菌的分离 将根表面的土剥离，用灭过菌的刷子取附着在根系表面的根际土样0.1 g 加入0.1 mL无菌水中，梯度稀释至 10−5，分别从稀释度为 10−3、10−4、10−5的稀释液中取 0.1 mL 涂布固体 LB 平板，根据菌落不同的形态选取菌株，用灭过菌的牙签点接在含 0、0.5、1.0 mmol·L−1镉（CdCl2·2.5H2O）的平板上，选取能在 1.0 mmol·L−1平板上稳定生长的菌株保存在−80 ℃冰箱中，作为后续菌株。

1.2.2 耐镉菌株促生特性的研究 吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）的测定参考Gordon 等［16］的方法；溶磷能力的测定参考黄静等［17］的方法，用溶磷圈直径（D）与菌株直径（d）的比值（D/d）表示溶磷能力的大小；产ACC 脱氨酶能力的测定参考夏娟娟［18］的方法；产铁载体能力的测定参考Kumar 等［19］的方法。

1.2.3 促生试验 综合促生特性指标，选出具有促生潜能的菌株进行水培促生试验。将一年生黑麦草牧瑶（IdyⅡ）种子用10%过氧化氢表面消毒15 min，去离子水冲洗几遍，采用漂洗法进行种子萌发。6 d 后选取生长一致的幼苗移栽到1 L 的塑料桶（12 cm×12 cm×14 cm）中进行营养液（1/4 Hoagland，pH 6.5）培养，长至三叶一心期镉处理9 d，此时换为1/2 Hoagland 营养液。每次更换营养液时用菌液浸根1.5 h，每个处理设置3 个重复。收苗测定株高、生物量、微波消解后用电感耦合等离子发射光谱仪（NexION 2000，PerkinElmer，USA）测定镉含量。镉积累量计算公式：Cd 积累量=生物量（根系或地上部干重）×植物组织中Cd 浓度。

菌悬液的制备：菌株接入液体LB 培养基（蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，去离子水1000 mL，pH=7.0）中，28 ℃、（180±20）r·min−1培养 12 h。5000 r·min−1离心 10 min，无菌水洗涤两遍，最后用无菌水重新悬浮，使OD600为 1。

1.2.4 菌株鉴定 利用细菌通用引物进行PCR 扩增，以获得细菌的16S rRNA。以菌株的总DNA 为模板，进行PCR 扩增。之后将16S rRNA 基因扩增产物送至金唯智生物科技有限公司进行测序。将获得的16S rDNA 序列与NCBI 的Genbank 基因库中的数据进行BLAST 比对，与其中的已知序列进行同源性分析。

1.3 盆栽试验

1.3.1 试验设计 盆栽试验在南京农业大学牌楼实验基地进行，土壤样品风干过筛后加镉。配置一定浓度CdCl2·2.5H2O 水溶液，用喷壶将含镉母液加到土壤中混合均匀，使镉的最终浓度为（19.5±0.42）mg·kg−1。使用大小一致的塑料盆，每个盆中装约5 kg 的土壤，每个处理3 个重复，选取耐镉性不同的一年生黑麦草品种［20−21］（耐镉型IdyⅡ和镉敏感型Wasehope）进行盆栽试验。水培黑麦草至三叶一心期移苗，移前用菌液浸根1.5 h，对照用无菌水浸根。每盆6 棵苗，培养60 d 后收苗。

1.3.2 样品处理 收苗前测定株高、分蘖数。将黑麦草沿着土壤表面剪下，将盆栽土壤浸在水中反复冲洗，洗净根系表面的土壤，将根取出。测定干鲜重及镉含量，同时取盆栽土样风干后研磨过孔径0.15 mm 筛，采用DTPA 法［22］测定土壤有效态镉含量。采用95%乙醇提取法测定叶绿素含量。用Li6400 光合仪进行光合参数的测定，测定时采用开放气路，将叶室 CO2浓度设置成 400 μmol·m−2·s−1，每个处理 3 个重复，取各项平均值。

1.4 数据分析

利用Excel 2016 整理数据，采用SPSS 25.0 进行方差分析，采用Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 耐镉菌株的筛选及促生特性研究

通过平板试验，共筛选出30 株在含1.0 mmol·L−1镉平板上生长的菌株，经过促生特性研究及促生试验筛选，选择Pi01 和Ma02 作为供试菌株（表1）。2 株菌均能产生IAA、铁载体，此外，Ma02 还具有溶磷能力（表2）。

表1 30 株耐镉菌促生特性Table 1 Characteristics of 30 cadmium tolerant strains

表2 供试菌株促生特性Table 2 Promoting characteristics of tested strains

2.2 菌株鉴定

测序结果与GenBank 中其他菌株的16S rRNA 基因序列进行比对，结合菌株形态，鉴定结果见表3 和表4。菌株 Ma02 和 Pi01 均为肠杆菌属（Enterobactersp.）。

表3 菌株革兰氏染色结果Table 3 Strains of gram stain results

表4 菌株鉴定结果Table 4 Strain identification results

2.3 不同处理下PGPR 对两种一年生黑麦草生长参数的影响

接种Pi01 和Ma02，与空白对照组相比，Idy Ⅱ和Wasehope 分蘖数分别增加23.6%、23.6% 和11.3%、17.0%，差异显著（P＜0.05）。镉处理下，接种Pi01、Ma02，IdyⅡ分蘖数增加44.2%、48.8%，Wasehope 分蘖数增加19.5%、46.3%，差异显著（P＜0.05，图1A）。

与单一镉处理相比，只接种Pi01 和Ma02 黑麦草的株高有所提高，IdyⅡ株高增加27.6%且达到显著水平（P＜0.05）；镉处理后，接种Ma02，Wasehope 株高增加12.3%，差异显著（P＜0.05，图1B）。接菌处理后，IdyⅡ和Wasehope 的干重均有所增加。单独接菌处理，与空白对照相比，接种Ma02 后IdyⅡ地上部干重显著增加；镉处理下，接种Ma02，IdyⅡ和Wasehope 地上部干重增加44.9%、51.3%；接种Pi01，IdyⅡ地上部干重增加39.1%，差异均显著（P＜0.05，图1C）。镉处理下，接种Pi01、Ma02，IdyⅡ和Wasehope 地下部干重分别增加20.8%、25.4%和28.0%、36.9%，差异均显著（P＜0.05，图1D）。

图1 不同处理对两种一年生黑麦草分蘖数、株高和干重的影响Fig. 1 Effects of different treatments on the tiller number，plant height，and dry weight of two annual ryegrass species（mean±SD，n=3）

2.4 不同处理下PGPR 对两种一年生黑麦草镉含量的影响

接种两种PGPR 后，地上部及地下部镉浓度均有所增加。其中，在镉处理下，接种Pi01 后，IdyⅡ地上部镉浓度比单一镉处理对照增加21.8%，差异显著（P＜0.05，图2A）；在镉处理下，接种Pi01 后，IdyⅡ地下部镉浓度比单一镉处理对照增加25.5%，接种Ma02 后，IdyⅡ和Wasehope 地下部镉浓度增加24.3% 和37.2%，差异均显著（P＜0.05，图2B）。

图2 不同处理对两种一年生黑麦草镉浓度、转运系数、镉积累量和镉积累总量的影响Fig. 2 Effects of different treatments on cadmium concentration，translocation factor，cadmium accumulation and cadmium accumulation of two annual ryegrass species（mean±SD，n=3）

镉处理下，接种两种PGPR 对两种一年生黑麦草镉吸收积累方面的影响较为显著，接种Pi01、Ma02 后，IdyⅡ和Wasehope 的地上部镉积累量分别增加69.0%、61.7%和49.5%、76.1%，差异均显著（P＜0.05，图2D）；接种Pi01、Ma02 后，IdyⅡ和Wasehope 的地下部镉积累量分别增加51.6%、49.3%和57.2%、85.5%，差异均显著（P＜0.05，图2E）。

就镉积累总量而言，镉胁迫下接种Pi01、Ma02，IdyⅡ和Wasehope 的镉积累总量分别增加62.6%、57.2% 和52.0%、79.2%，差异均显著（P＜0.05，图2F）。镉处理同时接种PGPR，镉的转运系数略有降低，未形成差异（图2C）。

2.5 不同处理下PGPR 对两种一年生黑麦草叶绿素含量的影响

无镉处理时，接种Ma02，IdyⅡ和Wasehope 的叶绿素含量增加24.4%、17.7%，达到显著差异水平（P＜0.05）。镉处理的同时接种 Pi01、Ma02，与单一镉处理对照相比，IdyⅡ的叶绿素含量增加24.7%、41.9%，形成显著差异（P＜0.05，图3）。

图3 不同处理对两种一年生黑麦草叶绿素含量的影响Fig. 3 Effects of different treatments on the total chlorophyll content of two annual ryegrass species（mean±SD，n=3）

镉处理后，与空白对照相比，两种一年生黑麦草的净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（stomatal conductance，Gs）、蒸腾速率（transpiration rate，Tr）均下降，胞间二氧化碳浓度（intercellular CO2concentration，Ci）升高。但镉处理同时接种Ma02 后，IdyⅡ的净光合速率较单一镉处理增加27.8%，差异显著（P＜0.05，图4A）。镉处理同时分别接种Pi01 和Ma02，一年生黑麦草Wasehope 的气孔导度较单一镉处理分别增加34.0%，48.2%（图4B），胞间二氧化碳浓度减少8.9%、8.5%（图4C），均达显著差异（P＜0.05）。镉处理时接种Ma02，IdyⅡ的蒸腾速率（Tr）较单一镉处理增加37.6%（图4D），达到显著差异（P＜0.05）。

图4 不同处理对两种一年生黑麦草Pn，Gs，Ci和Tr的影响Fig.4 Effects of different treatments on Pn，Gs，Ci and Tr of two annual ryegrass（mean±SD，n=3）

2.6 PGPR 对根际土壤中镉的生物有效性含量变化的影响

镉的生物有效性指可以被植物利用的那部分，其主要取决于土壤对镉的吸附能力。镉处理的同时接种Pi01 与单一镉处理相比，IdyⅡ和Wasehope 根际土壤镉有效态增加9.1% 和7.2%，差异性显著（P＜0.05）；接种Ma02 后，两种一年生黑麦草根际土壤有效态均增加但未达到显著差异（图5）。

图5 不同处理对两种一年生黑麦草根际土壤镉有效态的影响Fig. 5 Effects of different treatments on the available cadmium in the rhizosphere soil of two annual ryegrass（mean±SD，n=3）

3 讨论

植物−微生物联合修复重金属污染土壤具有原位、环保、费用低等优点，在修复方面前景广阔。PGPR 通过分泌IAA、溶磷、产生铁载体、产生ACC 脱氨酶降低乙烯水平促进植物生长，增加其生物量［23−24］。本研究中使用的 PGPR 具有上述部分特征（表 2）。Akmak［25］将有多种促生特性的 PGPR 接种到茶树（Camellia sinensis）上，发现其增加了茶树的株高、分蘖数，本研究中的结果与之相似（图1A，B）。Kamran 等［26］在镉胁迫下接种假单胞菌可促进芥菜（Brassica juncea）的生长；Khanna 等［27］将铜绿假单胞菌和剑兰伯克霍尔德氏菌接种到番茄（Solanum lycopersicum）上，提高了番茄的生物量；Ferchichi 等［28］研究发现，在田间条件下，菌株LJ121和LJ215 能够增加羽扇豆（Lupinus micranthus）的籽粒产量。此外，PGPR 可以分泌有机酸物质，降低土壤pH，使土壤中的不溶态磷转化为植物可以吸收的形态，来促进植物生长。本试验中，镉胁迫后接种PGPR，两种一年生黑麦草地上部及地下部的干重显著增加，敏感型品种Wasehope 地下部干重增幅更大，促生效果表现较为突出（图1D）。这可能归因于PGPR 产生IAA 的能力，作为一种信号分子，IAA 在植物及其内生微生物的相互作用中起着关键作用。但是，PGPR 和IAA 对植物生长和重金属吸收的影响尚不清楚。

镉胁迫可影响光合作用、根系呼吸等生理过程。叶绿素含量被认为是光合作用的指标。镉处理大幅降低了叶绿素含量（图3），说明镉对光合作用有不利影响。接种PGPR 可增加叶绿素含量，改善了光合作用，缓解镉胁迫下黑麦草Pn、Gs、Tr的下降和Ci的增加（图4），这可能是黑麦草生物量增加的原因。本试验中接种PGPR 后两种黑麦草的叶绿素含量均有所增加，试验结果与Wali 等［29］的一致。植物各器官中，根系在金属吸收和转运中起着不可代替的作用，它最先感知到镉胁迫，随着镉浓度增加，紫花苜蓿（Medicago sativa）根系总表面积、总体积、平均直径等显著下降［30］。根系形态改善使得根系体积增加，增大了与镉的接触面积，加大了镉的积累。

接种 PGPR 可增加植物中镉的积累量。Wang 等［31］在研究中发现，用 2 μmol·L−1镉处理，与对照组相比，接种植物促生菌芥菜地上部的镉积累达261%，在根系的积累达8.93 倍。Itusha 等［32］的盆栽研究表明，与对照相比，接种PGPR 香根草（Vetiveria zizanioides）的根长和株高分别增加了21.4%和17.36%，镉的吸收增加了67.7%。Asad 等［33］将 HRS-C3 接种到甘蓝（Brassica oleracea），发现其干重从 214.50 mg 增加至 295.30 mg，且增加了对镉的吸收。接种PGPR 能够活化土壤中的有效态镉，使其含量增加（图5），与Han 等［34］的结果相同。本试验中，接种PGPR 后能增加耐镉性不同的两种一年生黑麦草的镉含量，这一现象可以解释为，一方面接种PGPR 增加了黑麦草的生物量，另一方面PGPR 接种活化土壤中的镉促进了黑麦草对镉的吸收，进一步导致了镉的高积累，并且在敏感型品种Wasehope 中单株镉积累量更高（图2F），这说明在（19.5±0.42）mg·kg−1的镉污染土地上适宜种植Wasehope，可开发其作为能源植物的潜力。此外，与Wasehope 相比，IdyII 地上部及地下部相对较低的镉浓度表明IdyII 可能是一个镉排斥型品种（图2A，B），这种作用机制还需要进一步研究。

4 结论

综上所述，从镉污染地区植物根际土壤中筛选出的2 株PGPR 都能促进一年生黑麦草的生长。镉胁迫下接种PGPR 能够增加一年生黑麦草的株高、分蘖数、生物量，提高叶绿素、改善光合作用。就镉含量而言，在本试验条件下种植Wasehope 更利于土壤修复，但是PGPR 促生的稳定性还需开展长期田间试验。