槲皮素对应激致小鼠抑郁症的作用及相关机制

华深 罗晓东 徐波 陈建民

应激是指生存环境中多种负向因素刺激机体后，导致神经、内分泌等内环境发生的变化，适当的应激能够提高个体对环境的适应能力，但过度应激会诱导心理、生理等障碍，其中以抑郁症较为常见。相关研究表明，我国抑郁症发病率呈逐年上升趋势，发病人群呈年轻化；该病对患者的正常生活、工作等均有不同程度的影响，甚者可导致患者自杀[1]。槲皮素是植物中类黄酮的一种成分，具有抗炎、保护心血管、治疗退化性疾病等作用，目前常用于神经系统疾病、癌症、肥胖症等临床治疗[2-4]，而对应激所致抑郁症的治疗研究甚少。基于此，本研究通过动物实验就槲皮素对应激所致抑郁症的作用及相关机制作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性、体质量20～25 g、4周龄、清洁级C57BL/6小鼠90只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。小鼠饲养环境符合动物实验研究相关伦理学要求：分笼饲养于不锈钢笼内，自由进食及饮水，每天8：00-20：00给予光照，保持温度24℃、湿度60%；适应1周后经一般检疫均为健康动物。

1.2 试剂与仪器 槲皮素（批号：337951，规格：纯度95%）由美国Sigma公司生产；SuperMaze旷场实验分析系统由上海欣软信息科技有限公司生产；Any Maze条件恐惧系统由意大利Ugo Basile公司生产；旷场检测系统由上海吉量公司生产；自动酶标仪DR-200Bs由华卫德朗仪器有限公司生产；超声细胞粉碎机scientz-IID由新芝生物科技股份有限公司生产；低温离心机由德国Eppendorf公司生产；小鼠束缚管、悬尾及强迫游泳装置自制。

1.3 动物分组与处理 将90只小鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、高剂量槲皮素组、中剂量槲皮素组、低剂量槲皮素组，每组18只。除对照组外，其他4组均采用慢性不可预知性应激制备抑郁模型：应激源包括电击（6 次/d，3 s/次，间隔 3 s）、噪声（30 min）、昼夜颠倒（12 h/24 h）、闪光（12 h）、湿笼（8 h）、倾笼 45°（24 h）、束缚（3 h）、禁水（24 h）、禁食（24 h）等，每天随机选择 3种应激源，但同一应激方式不连续应用，连续给予应激4周。从应激处理第3周开始，高、中、低剂量槲皮素组分别给予5、10、20 mg/（kg·d）的槲皮素（溶于2 ml 0.9%氯化钠溶液中）灌胃干预，模型组、对照组小鼠给予2 ml 0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d。本实验在金华市实验动物中心完成，所有实验程序按照实验动物中心的批准协议进行。

1.4 观察指标 造模期间，每周记录小鼠体质量变化；造模结束后，采用旷场活动实验、强迫游泳实验、悬尾实验测定小鼠抑郁行为，然后断头取脑、分离海马组织并测定 IL-1β、TNF-α、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平。（1）旷场活动实验：在实验箱中央位置（正中15 cm×15 cm区域，底面为5 cm×5 cm的9个方格）放1只小鼠，记录小鼠15 min内活动路程，即四肢均进入方格的穿越格数。（2）强迫游泳实验：在一个安静的测试房内让小鼠先熟悉环境1 h，使其放松；然后将小鼠放入2 000 ml烧杯（水深12 cm，水温22℃）中6 min，然后记录后4 min内小鼠不动时间，即小鼠漂浮于水面不动或在睡眠中轻微游动的时间。（3）悬尾实验：在一个安静的测试房内让小鼠先熟悉环境1 h，使其放松；然后用胶带将小鼠尾巴固定在实验架上，悬挂6 min，然后记录后4 min内小鼠不动时间，即小鼠停止挣扎后完全不动的时间。（4）海马组织 IL-1β、TNF-α、5-HT 及BDNF水平检测：采用ELISA法。将海马组织置于0.9%氯化钠溶液中，按10%比例在0～4℃下制成匀浆，离心后取上清液。使用相应的ELISA试剂盒（美国Sigma公司）检测上清液中IL-1β、TNF-α、5-HT及BDNF水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠造模期间体质量变化比较 造模第1周，各组小鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；造模第2周，对照组体质量明显高于模型组、高剂量槲皮素组、中剂量槲皮素组、低剂量槲皮素组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；造模第3、4周，各组小鼠体质量比较，对照组＞高剂量槲皮素组＞中剂量槲皮素组＞低剂量槲皮素组＞模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1。

表1 各组小鼠造模期间体质量变化比较（g）

2.2 各组小鼠抑郁行为比较 造模结束后，各组小鼠旷场活动路程比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；游泳不动时间、悬尾不动时间比较，对照组＞高剂量槲皮素组＞中剂量槲皮素组＞低剂量槲皮素组＞模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠抑郁行为比较

2.3 各组小鼠海马组织 IL-1β、TNF-α、5-HT、BDNF 表达比较 造模结束后，各组小鼠海马组织IL-1β、TNF-α、5-HT、BDNF 表达比较，IL-1β、TNF-α 表达为对照组＜高剂量槲皮素组＜中剂量槲皮素组＜低剂量槲皮素组＜模型组，5-HT、BDNF表达为对照组＞高剂量槲皮素组＞中剂量槲皮素组＞低剂量槲皮素组＞模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠海马组织IL-1β、TNF-α、5-HT、BDNF表达比较

3 讨论

抑郁症是一种以情绪低落、社会活动能力差等为主要表现的心境或情感障碍类疾病，可对认知功能造成影响，进而诱发相关的躯体性疾病[5]。该病的临床特点为高发病率、高复发率及高致残率。目前，临床上通常采用单胺氧化酶抑制剂、5-HT再摄取抑制剂及三环类、四环类等药物治疗抑郁症，但这些药物在缓解抑郁症状的同时伴有不同程度的不良反应，具有一定的局限性[6]。故采用积极有效的抗抑郁药物能够缓解患者的抑郁症状，减少不良反应，提高患者治疗依从性，对临床具有重要的意义。槲皮素又称为栎精、槲皮黄素，从多种植物的花、叶、果种中提取获得，属于天然黄酮类化合物，化学名为3，3'，4，5，7-五羟基黄酮，分子式为 C15H10O7，分子量为302.24[7-8]。目前研究证实，槲皮素能够有效治疗神经系统疾病、骨科疾病以及心、肝、肾等脏器疾病。聂晶鑫等[9]研究证实，槲皮素能促使脊髓损伤大鼠神经元自噬水平恢复正常，从而降低脊髓神经元损伤程度。雷晓鸣等[10]研究证实，槲皮素能够抑制细胞凋亡，提高全脑缺血/再灌注大鼠的学习和记忆能力。但关于槲皮素对抑郁症的治疗作用相关研究较少，故本研究作一探讨。

研究证实，慢性应激及急性应激均能够诱发抑郁行为[11]。故本研究采用慢性不可预知性温和应激制备小鼠抑郁模型，并通过小鼠体质量观察、旷场活动实验、强迫游泳实验和悬尾实验评估小鼠抑郁行为，结果显示模型组小鼠体质量下降，在强迫游泳及悬尾实验中不动时间延长，而旷场活动路程无明显变化，提示抑郁模型构建成功。强迫游泳及悬尾实验中不动时间延长意味着绝望和失望时间延长，体现小鼠意志减弱，负面情绪增加，自主行为及探索行为缺乏。经槲皮素干预的小鼠体质量明显增加，强迫游泳及悬尾实验中不动时间明显缩短，且20 mg/（kg·d）剂量组改善最明显。提示槲皮素具有一定的抗抑郁作用，且与剂量密切相关。

抑郁症的发生与海马组织结构损伤密切相关。有临床试验和动物试验证实，长期应激刺激可对海马组织造成损伤，同时诱导小胶质细胞和星形胶质细胞激活，进而导致神经炎症反应，造成炎症因子水平升高，最终导致抑郁行为[12-13]。既往研究证实，慢性应激会介导海马组织发生炎症反应，降低BDNF表达，而增加BDNF表达能够抑制神经炎症及细胞凋亡[14-15]。5-HT是参与调控情绪的重要神经递质，能作为抑郁症治疗的靶点。因此，本研究对槲皮素抗抑郁的作用机制作了进一步探讨，结果发现海马组织IL-1β、TNF-α表达为对照组＜高剂量槲皮素组＜中剂量槲皮素组＜低剂量槲皮素组＜模型组，5-HT、BDNF表达为对照组＞高剂量槲皮素组＞中剂量槲皮素组＞低剂量槲皮素组＞模型组，差异均有统计学意义。提示槲皮素通过降低IL-1β、TNF-α表达同时升高5-HT、BDNF表达来发挥抗抑郁作用。但本研究仅限于海马组织，而大脑组织及结构较为复杂，抑郁症与前额叶皮层、杏仁核、大脑皮层等情绪相关部位的机制如何，仍需进一步研究证实。

综上所述，槲皮素具有抗抑郁作用，其作用机制可能是降低海马组织IL-1β、TNF-α表达，同时提高5-HT、BDNF表达。