血栓靶向相变纳米粒穿透深度与其溶栓效果相关性的实验研究

钟毅欣 叶曼 徐杰 张文丽 胡柳 方霓 郭大静

动脉血栓性疾病具有较高的致死率和致残率［1］，阿替普酶作为美国食品药品管理局唯一批准的溶栓药物，其临床应用具有一定优势，但由于其较窄的时间窗和未知的副作用，广泛应用受到限制［2］。以纳米技术为基础的分子影像学因其制备简单、多用途的整合功能备受关注，有望突破这一瓶颈［3］。本课题组前期已成功构建靶向血栓相变型纳米粒，低强度聚焦超声（LIFU）致全氟己烷（PFH）相变溶栓，体内外实验均取得了良好效果［4-5］。本实验在前期研究的基础上，建立动脉血栓的体外模型，进一步分析纳米粒穿透血栓深度与溶栓效果的相关性，探讨声致相变的纳米粒在动脉血栓中的应用价值。

材料与方法

一、实验动物

健康雌性新西兰大白兔5只，体质量4.5～5.0 kg，平均（4.75±0.25）kg，均购于重庆医科大学动物实验中心。雌性SD大鼠10只，10～12周龄，体质量280～320 g，平均（290.00±12.80）g，均于SPF级动物喂养中心进行饲养。所有实验操作均经重庆医科大学动物伦理委员会批准。

二、主要实验试剂与仪器

1.主要试剂：聚乳酸羟基乙酸（PLGA，分子量8000，济南岱罡生物工程有限公司）；PFH（北京百灵威科技有限公司）；CREKA多肽、人纤维蛋白原（江苏强耀生物科技有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、2-吗啉乙磺酸（MES）、聚乙烯醇（美国Sigma-Aldrich公司）；异丙醇、二氯甲烷（成都科龙公司）；Di I染色剂（上海碧云天生物技术有限公司）；OCT包埋剂（日本樱花公司）；PBS溶液（武汉赛维尔公司）；戊巴比妥钠（吉林大学医学院自制）。

2.主要仪器：超声波破碎仪（美国Sonics公司）；共聚焦显微镜（日本尼康公司）；LIFU治疗仪（重庆海扶医疗科技股份有限公司）；马尔文粒径仪（Zetasizer Nano ZS90，英国马尔文仪器有限公司）；透射电子显微镜（H 7500，日本日立公司），流式细胞仪（FACS Vantage，美国Becton Dickinson公司）；倒置荧光显微镜（CKX41，日本奥林巴斯公司）。

三、实验方法

1.制备靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒：通过改良的W/O/W双乳化挥发方法制备相变型纳米粒。取50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷，加入200μl的PFH溶液作为内水相，冰浴下超声波破碎仪工作1 min，功率30 W；加入4%聚乙烯醇溶液5 ml作为外水相，继续声振1 min，功率30 W；然后加入10 ml浓度2%的异丙醇溶液，冰浴下搅拌3 h，使PLGA-PFH纳米粒表面固化。根据碳二亚胺法将制得的PLGAPFH纳米粒离心洗涤后，用0.1 M的MES（pH值5.2）溶液重悬，EDC和NHS按照摩尔比2∶1加入，冰浴条件下孵育3 h。去除未反应的EDC、NHS，加入0.1 M的MES（pH值8.0）重悬后加入5 mg CREKA多肽，冰浴条件下孵育12 h，即制得PLGA-PFH-CREKA纳米粒，置于4℃冰箱中备用。

2.靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒的理化特性：以1 ml的注射器将样品滴于铜网上，待完全干透后置于透射电镜下观察其结构；马尔文粒径仪测量纳米粒大小及表面Zeta电位；流式细胞仪半定量分析纳米粒与CREKA多肽的连接率。将其置于特定的凝胶模具中，使用LIFU（1 W/cm2）辐照15 min，于光镜下观察辐照前后纳米粒的形态变化。

3.靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒对体外血栓深度的穿透性：采血针穿刺入新西兰大白兔耳缘动脉，10 ml负压采血管收集血液，置于37℃的水浴锅4 h，将血块切成小块（大小1.0 cm×0.3 cm×0.3 cm，重约300 mg），PBS溶液清洗3次。PLGA-PFH-CREKA纳米粒用DiI染色剂标记，将血凝块置于自制的凝胶模具中，加入PLGA-PFH-CREKA纳米粒为兔靶向PT组，不加CREKA多肽的纳米粒为兔非靶向PT组，以相同容量的双蒸水替代PFH为非相变组（NPT组）。将制得的纳米粒按照2 mg/ml的浓度配置成25 ml，LIFU（1 W/cm2）辐照2 h，焦距28 mm，然后用滤纸吸去血凝块表面的水分，记录其质量，计算溶栓率，公式为溶栓率=（溶栓前质量-溶栓后质量）/溶栓前质量×100%。血凝块以OCT包埋，制作冰冻切片，厚度50μm，置于共聚焦显微镜下观察血栓穿透深度（即血栓边缘到荧光消失的距离）。

4.靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒对体内血栓的靶向性：以1%戊巴比妥钠麻醉SD大鼠，建立腹主动脉附壁血栓模型，将Alexa 488标记的人纤维蛋白原（10 mg/kg）注入尾静脉，备皮后打开腹腔，止血钳游离腹主动脉，10%氯化铁溶液浸湿滤纸，包裹其外周1圈，4 min后取出滤纸，并用生理盐水清洗。SD大鼠随机分为两组，分别注射1 mg/ml浓度的DiI染色剂标记的靶向纳米粒（大鼠靶向PT组）和非靶向纳米粒（大鼠非靶向PT组）。待血液循环3 h后处死动物，取出该段腹主动脉，生理盐水清洗2次，OCT包埋，制作冰冻切片后倒置于荧光显微镜下观察纳米粒的体内靶向性。

四、统计学处理

应用SPSS 22.0统计软件，计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析；两组比较行Post-hoc事后检验。应用线性回归分析溶栓率与血栓穿透深度间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、PLGA-PFH-CREKA纳米粒的理化特性

制备的PLGA-PFH-CREKA纳米粒平均粒径为（297.8±11.82）nm，表面平均电位为（1.44±0.22）mV，多分散系数为0.067±0.038。透射电镜显示纳米粒为均匀球体，分散性好（图1A）。流式细胞仪检查示在随机计数的10000个纳米粒中，有9534个纳米粒波长发生了改变，即95.34%的纳米粒与CREKA多肽成功连接。LIFU辐照前后可见纳米粒明显膨胀（图1B、C）。

图1 靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒的理化特性

二、靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒对体外血栓深度的穿透性

LIFU辐照2 h后，各组对体外血栓深度的穿透性见图2。共聚焦显微镜显示兔靶向PT组血栓深处可见荧光；兔非靶向PT组血凝块边缘荧光强度较弱，其深部未见明显荧光分布；NPT组血凝块边缘可见荧光分布，但血凝块深部未见明显荧光信号。兔靶向PT组、兔非靶向PT组、NPT组对血栓的穿透深度分别为（293.01±24.61）μm、（114.52±23.85）μm、（116.78±28.06）μm，差异有统计学意义（F=96.187，P<0.001）；兔靶向PT组与兔非靶向PT组和NPT组比较差异均有统计学意义（均P<0.001），NPT组与兔非靶向PT组比较差异无统计学意义。兔靶向PT组、兔非靶向PT组及NPT组靶向溶栓率分别为（60.67±4.37）%、（45.83±6.88）%、（18.67±1.78）%，差异有统计学意义（F=108.508，P<0.001）；组间两两比较差异均有统计学意义（均P<0.001）。

图2 各组血栓切片的激光共聚焦三维重建图（×200）

三、相关性分析

线性回归分析显示，兔靶向PT组的溶栓率与血栓穿透深度之间存在线性相关（R2=0.818，P<0.05）；兔非靶向PT组、NPT组的溶栓率与血栓穿透深度之间无明显相关（R2=0.005、0.021）。

四、靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒的体内靶向性

大鼠靶向PT组中，DiI染色剂标记的纳米粒呈红色，其与Alexa 488标记的纤维蛋白分布大部分一致。大鼠非靶向PT组中，DiI染色剂标记的纳米粒红色荧光较少，在通道合并图片中未与纤维蛋白明显重合（图3）。

图3 大鼠靶向PT组与大鼠非靶向PT组体内荧光图（×100）

讨论

早期发现和及时治疗对于动脉血栓形成患者的远期康复至关重要。目前的治疗方式主要使用静脉给药或通过介入手术的方式直接动脉给药，但由于阿替普酶在血液循环中不受限制，会导致患者出现症状性颅内出血、缺血再灌注损伤及神经中枢中毒等症状。因此，临床亟需探寻一种效益高、剂量可控的方式。通过双乳化法制备的PLGA-PFH-CREKA纳米粒由于其良好的生物相容性，已在纳米给药系统中引起广泛关注，相较于单乳化法，双乳化法可提高亲水性材料的包封率［6］。同时，分子量8000的PLGA聚合链短，降解速度更快，可保证纳米粒的安全性，这一点在前期研究［4-5，7］中也得到证实，故本实验采用双乳化法制备靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒。

除外制备方式，粒径大小作为血管内给药的一项关键参数也值得注意。研究［8］显示，粒径<10 nm的粒子通常经肾脏滤过和组织外渗而排出，>20 nm的粒子通过网状内皮系统在血液循环中清除，而粒径为300 nm的粒子适用于血管内给药，且血管内给药的有效性具有独特优势，因此，本实验制备的PLGA-PFH-CREKA纳米粒大小均匀，分散性较好，粒径在300 nm左右，适用于血管内血栓的研究。与前期研究［5］相比，本实验未加入氧化铁纳米粒，原因在于相变型纳米粒的溶栓主要与PFH和超声的联合作用有关，氧化铁的目的在于显像，但从显像的角度出发，需要研发一种效果更佳、更灵敏的集诊疗一体化的纳米粒，故本实验未加入除PFH的其他显像剂。

液态氟碳是含氟脂肪族化合物的一种，近年来主要用于超声和MRI显像，其特殊的液气相变过程为肿瘤治疗带来了新方法［9］。前期研究［5］选择携PFH及氧化铁的相变型纳米粒进行溶栓实验，发现LIFU的声功率密度仅需1 W/cm2即可将该纳米粒激活，使其从液态转变为气态，达到破坏血栓的目的。为进一步验证在1 W/cm2LIFU的辐照下相变型纳米粒穿透血栓的深度对溶栓效果的影响，本实验制备了未携带氧化铁的PLGA-PFH-CREKA纳米粒，其在溶栓方面也展现出一定优势，经LIFU辐照2 h后，兔靶向PT组的血栓穿透深度为（293.01±24.61）μm，而兔非靶向PT组和NPT组 的 血 栓 穿 透 深 度 分 别 为（114.52±23.85）μm、（116.78±28.06）μm，推测在LIFU的作用下，通过超声的热效应、机械效应等物理作用可以使血栓疏松，有助于纳米粒渗透，与肿瘤的相关研究［10］结论类似。本实验结果显示，兔靶向PT组的溶栓率与血栓穿透深度呈正相关（R2=0.818，P<0.05），证实靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒对血栓的穿透深度在一定程度上可影响治疗效果，值得今后进一步探究。

在血栓形成过程中，纤维蛋白有重要作用，与抗体相比，本实验采用靶向纤维蛋白的多肽，血液清除率和穿透纤维蛋白网的能力均更佳，可进一步提高目标背景比［11］。体内靶向性实验显示大鼠靶向PT组中DiI染色剂标记的纳米粒呈红色，其与Alexa 488标记的纤维蛋白分布大部分一致，进一步证实携CREKA多肽的纳米粒较未携带的纳米粒在血栓区域的滞留更多，说明携CREKA多肽的纳米粒具有良好的靶向性。另外，本实验结果显示，兔靶向PT组与兔非靶向PT组溶栓率比较差异有统计学意义（P<0.001），说明携带靶向纤维蛋白的CREKA多肽可放大PLGA-PFH-CREKA纳米粒的溶栓效果。但受LIFU探头辐照面积和深度衰减的影响，相变型纳米粒的溶栓效果还需进一步提高，今后可通过改进LIFU设备、相变型纳米粒的响应机制及对血栓穿透的机制进行解决，这也是未来研究的方向。

综上所述，本实验成功制备靶向纤维蛋白的PLGA-PFH-CREKA纳米粒，对血栓纤维蛋白有良好的靶向性，且与血栓穿透深度相关。这种以相变型纳米粒作为溶栓介质的方法，有望通过其机械作用及扩大溶栓治疗的时间窗为临床治疗方式的研究带来新思路。