脂多糖环境下银纳米颗粒对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

赵忠福 李晓光 邹德勋 孙兰春 姚宏波

1 齐齐哈尔医学院附属第二医院骨外科 （黑龙江 齐齐哈尔 161006）

2 齐齐哈尔医学院附属第二医院心内科 （黑龙江 齐齐哈尔 161006）

3 齐齐哈尔医学院基础医学院组织胚胎学教研室 （黑龙江 齐齐哈尔 161006）

内容提要：目的：阐明细胞炎症环境下，银纳米颗粒（AgNP）对人骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖和成骨分化的影响及作用机制。方法：150μg/L脂多糖（LPS）建立细胞炎症模型。在细胞炎症模型条件下BMSC分为：炎症对照组、炎症AgNP组和炎症Akt抑制剂组。正常环境下BSMC分为正常对照组和正常AgNP组。各组BMSC均进行21d成骨诱导。再分别以MTT、Western blot检测各组BMSC增殖吸光度值（A值）和Caspase 3蛋白的表达；ELISA或Western blot检测各组BMSCs的骨形成蛋白-2（BMP-2）、碱性磷酸酶（ALP）含量或相对表达水平；ELISA检测各组BMSCs的总超氧化物歧化酶（Total-SOD）和丙二醛（MDA）含量；各组BMSCs均进行茜素红染色，计算光密度值（OD值）。结果：相对于正常对照组，正常AgNP组BMSCs的A值明显升高（P<0.01）；Caspase 3蛋白表达降低（P<0.01）；正常AgNP组BMSCs的BMP-2、ALP、Total-SOD蛋白表达或茜素红染色OD值均明显增加（P<0.01），正常AgNP组MDA表达显著降低（P<0.01）。与炎症对照组相比，炎症AgNP组BMSCs的A值明显提高（P<0.01）；Caspase 3蛋白表达显著降低（P<0.01）；炎症AgNP组BMP-2、ALP、Total-SOD表达或茜素红染色OD值均明显增加（P<0.01），MDA表达显著降低（P<0.01）。炎症Akt抑制剂组的BMP-2、ALP、Total-SOD、MDA表达相对于炎症AgNP组均呈相反趋势。结论：细胞炎症环境下，银纳米颗粒通过Akt信号通路提高Total-SOD等抗氧化酶的表达，促进BMSCs增殖和成骨分化。

据报道，骨关节假体、支架材料等骨科植入物感染发生率至少5.0%[1,2]，骨植入物感染不仅给患者带来严重后果，而且产生高昂的经济负担[3]。虽然在关节假体或骨植入物中添加庆大霉素、万古霉素等抗生素[4]，但是抗生素严重的副作用和细菌耐药性持续加剧，生物材料感染率一直居高不下[1,2]。因此，必须建立针对此类生物的充分预防措施。

银已被用作抗菌剂已有数百年历史。银纳米颗粒（Silver nanoparticles，AgNP）稳定释放银离子。由于Ag2+优选结合至硫、磷等电子供体基团，因此，AgNP能够与电子传输链中的含硫代谢酶或与富含磷的DNA相互作用，从而抑制微生物产生或传递能量过程[5]。研究发现，AgNP具有抑制革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌、真菌和病毒等广谱抗菌活性[6]，AgNP可被应用于生物材料合成、医用材料涂层等领域[7]。

骨髓内含有大量骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），BMSC能够分化为骨或软骨，BMSCs尚能分化为成骨细胞（Osteoblasts），参与促进骨组织修复和骨折愈合的过程，是硬组织工程研究重要的“种子细胞”[8]。评估细胞炎症环境下，AgNP对BMSC增殖、凋亡和成骨分化的影响效果和机制，扩展银纳米颗粒在临床应用提供理论依据。

1.资料与方法

1.1 细胞

hBMSCs购自广州赛业生物公司。

1.2 主要试剂和仪器

α-MEM培养基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（Hyclone公司）；10nm银纳米溶液、噻唑蓝（MTT）、脂多糖（LPS）、二甲基亚砜、β-甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C（Sigma-Aldrich公司）；Triciribine（Selleck公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒等Western blot试剂（碧云天生物科技公司）；茜素红染色试剂盒（南京建成试剂公司），人BMP-2、ALP、Total-SOD和MDA的ELISA试剂盒（R&D公司）；小鼠抗人Caspase 3抗体、小鼠抗人BMP-2抗体、小鼠抗人ALP抗体、小鼠抗人GAPDH抗体和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（Abcam公司），增强化学发光剂（Invitrogen公司）。Spectra Max190酶标仪（Molecular Devices公司）；FACSAria II流式细胞仪（BD公司）；IX53型倒置荧光显微镜（Olympus公司）。Tanon 6200发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及实验分组。含10%胎牛血清的α-MEM培养基为BMSC基础培养基。BMSC基础培养基含10mmol/L β-甘油磷酸钠、100μmmol/L地塞米松、0.1mmol/L维生素C则为BMSC成骨培养基。以150μg/L脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）建立细胞炎症模型。在细胞炎症模型下培养的BMSCs为炎症对照组，以5μmol/L AgNP刺激BMSC则为炎症AgNP组，若添加5μmol/L AgNP和5nmol/L Triciribine则为炎症Akt抑制剂组。正常培养条件下，无任何刺激培养的BMSCs为正常对照组，以0.01μg/L AgNP处理BMSC则为正常AgNP组。以上各组BMSCs均在37°C，5% CO2下，用BMSC成骨培养基诱导21d。

1.3.2 MTT实验检测BMSC吸光度。0.8×104/孔BMSCs加入96孔细胞培养板中，37°C，5% CO2培养12h；按照实验分组更换BMSC成骨培养基或不同试剂；每孔内添加5g/L MTT；37°C，5% CO2继续培养4h，再加入100μL二甲基亚砜，充分震荡。Spectra Max190酶标仪在490nm波长检测各组BMSC的吸光度值（Absorbance value，A值）。

1.3.3 Western blot检测BMSC的Caspase 3、BMP-2、ALP表达。4.0×106各组BMSCs用含1mmol/L苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液裂解。4°C，12000r/min离心5min，35μg各组BMSCs蛋白经10% SDS-PAGE电泳90min，转至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭60min；分别加入小鼠抗人Caspase 3抗体（1:550）、小鼠抗人BMP-2抗体（1:350）、小鼠抗人ALP抗体（1:500）、小鼠抗人GAPDH抗体（1:800），4°C过夜；加入HRP标记山羊抗小鼠IgG（1:700），室温孵育60min；增强化学发光剂显示蛋白条带，Tanon 6200发光成像分析系统显影。

1.3.4 茜素红染色检测BMSC的成骨分化。1.0×106各组BMSCs成骨诱导21d后，0.01mmol/L PBS冲洗3次，每次1min；4%多聚甲醛固定60min，1%茜素红染色60min，0.01mmol/L PBS漂洗3次，每次1min；IX53显微镜观察各组BMSCs钙化结晶的染色效果，Image-Pro Plus 6.0.1图像软件分析各组BMSCs的茜素红染色光密度值（Optical density value，OD）。

1.3.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测Total-SOD、MDA蛋白含量。4.0×106各组BMSCs在37°C，5% CO2环境中培养12h，0.01mmol/L PBS清洗3次，每次1min；RIPA裂解液裂解。4°C，10000r/min离心5min，取上清液，人ELISA试剂盒检测各组BMSCs的Total-SOD、MDA含量[9]。

1.4 统计学分析

实验数据采用SPSS 21.0软件进行统计与分析，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，两组间比较采用Q检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2.结果

2.1 AgNP对BMSCs增殖的影响

见图1。

图1 各组BMSCs的增殖A值比较（±s，n=15）

2.2 AgNP抑制Caspase 3蛋白表达

见图2。

图2 Western blot检测各组BMSCs的Caspase 3蛋白表达（±s,n=15）

2.3 AgNP促进BMSC茜素红染色光密度值表达

为了阐明AgNP对BMSC成骨分化的影响，茜素红染色实验发现：茜素红染色的形态学实验提示AgNP能够促进BMSC分化为成骨细胞（图3）。

图3 各组BMSC的茜素红染色（×100，±s，n=30）

2.4 AgNP对BMP-2、ALP蛋白表达的影响

为了进一步验证AgNP对BMSC成骨分化的影响，首先检测成骨特异性蛋白BMP-2、ALP含量（见表1）。接下来，Western blot检测BMP-2、ALP相对表达情况（图4）。两种实验均证明AgNP促进BMSC分化为成骨细胞，这种促进BMSC分化的作用可被Akt抑制剂阻断。

表1 各组BMSCs的BMP-2、ALP含量(±s,n=25)

表1 各组BMSCs的BMP-2、ALP含量(±s,n=25)

注：aP<0.01、bP<0.01，与正常对照组比较；cP<0.01、dP<0.01，与正常对照组比较；eP<0.01、fP<0.01，与炎症对照组比较；gP<0.01、hP<0.01，与炎症AgNP组比较。

images/BZ_6_1287_1994_2302_2255.png组别 BMP-2(μg/mL) ALP(U/mL)正常对照组 6.751±0.241 7.517±0.455 P P=0.0000 P=0.0000

表2 各组BMSCs的Total-SOD和MDA表达(±s,n=25)

表2 各组BMSCs的Total-SOD和MDA表达(±s,n=25)

注：aP<0.01、bP<0.01，与正常对照组比较；cP<0.01、dP<0.01，与正常对照组比较；eP<0.01、fP<0.01，与炎症对照组比较；gP<0.01、hP<0.01，与炎症AgNP组比较。

images/BZ_50_214_1072_1228_1321.png组别 Total-SOD(U/mL) MDA(μg/mL)正常对照组 85.068±1.542 7.095±0.518 P P=0.0000 P=0.0000

图4 各组BMSC的BMP-2、ALP蛋白表达（±s,n=30）

2.5 AgNP对Total-SOD、MDA蛋白表达的影响

为了进一步验证AgNP对BMSC影响的分子机制，检测Total-SOD、MDA氧化酶的表达。结果提示AgNPC能够促进BMSC表达Total-SOD，抑制MDA蛋白表达。

3.讨论

银作为非特异性杀菌剂，在治疗感染的起着重要作用[10]。银纳米颗粒（AgNP）大小是影响其抗菌活性水平的重要因素[11]。研究显示，直径10nm的AgNP有较大的表面积释放银离子，杀菌或抑菌效果更显著，因此本实验选择粒径10nm的AgNP为研究对象。

在细胞炎症模型下，相对于炎症对照组，炎症AgNP组的BMSC增殖A值显著提高，说明AgNP能够促进BMSC的增殖活性，其原因可能是由于AgNP具有较好的抗氧化、抑菌，能够提高细胞内抗氧化酶的表达[12]。炎症AgNP组的Caspase 3蛋白表达降低也间接验证了AgNP对BMSC具有抗氧化，抑制自由基活性的功能[13]。为了验证我们的分析，本实验以ELISA实验证明了炎症AgNP组Total-SOD蛋白高表达，使BMSC能够对抗炎症造成的高自由基环境。

本实验利用ELISA实验发现：与炎症对照组相比，炎症AgNP组MDA表达水平下降，再次表明AgNP在抗自由基损伤中起着重要作用。实验发现，与正常对照组相比，正常AgNP组BMSC的成骨细胞特异性BMP-2、ALP蛋白含量均显著高表达；细胞炎症环境下，相对于炎症对照组，炎症AgNP组BMSC的BMP-2、ALP蛋白含量均呈现升高趋势，这说明正常或细胞炎症环境下，AgNP均能够促进BMSC成骨分化。与炎症AgNP组相比，炎症Akt抑制剂组BMSC的BMP-2、ALP蛋白含量呈低表达，这些研究结果说明BMSC在AgNP的作用下具有较好的成骨分化能力。

综上所述，细胞炎症环境下，AgNP激活抗氧化酶，促进BMSC增殖和成骨分化，对提高BMSC抗炎反应，加速骨修复具有较好效果。