毛重楼叶绿体基因组序列特征及其系统发育分析

江 媛1，杨青淑1，王 婧1，杨成金，黄林芳，杨 燕，段宝忠

• 药材与资源 •

毛重楼叶绿体基因组序列特征及其系统发育分析

江 媛1,2，杨青淑1, 2，王 婧1, 2，杨成金3，黄林芳2，杨 燕4，段宝忠1*

1. 大理大学药学院，云南 大理 671000 2. 中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193 3. 云南白药集团中药资源有限公司，云南 昆明 650504 4. 云南省科学技术院，云南 昆明 650051

获取毛重楼叶绿体基因组信息特征并对其系统位置进行研究。采用Illumination测序技术对毛重楼叶绿体基因组进行测序，对其进行组装、注释和特征分析，并构建最大似然（maximum likelihood，ML）系统发育树。毛重楼叶绿体基因组大小为163 918 bp，总GC含量为37.05%，大单拷贝区（large single-copy，LSC）、小单拷贝区（small single-copy region，SSC）分别为84 173、13 054 bp，反向互补重复区（inverted repeats，IR）大小为33 296 bp，共编码113个基因，包括79个蛋白质编码基因，30个tRNA基因和4个rRNA基因。在系统进化树中，重楼属L.与藜芦科（Melanthiaceae Batsch ex Borkh.）关系较近，与百合科（Liliaceae Juss.）关系较远。LSC区和SSC区序列变异高于IR区；相较于重楼属，毛重楼与蚤休组的亲缘关系最近，应将毛重楼归属为蚤休组；相较于百合科，毛重楼与藜芦科藜芦属亲缘关系更近，应将蚤休组从百合科中独立，归属为藜芦科。

毛重楼；叶绿体基因组；重楼属；系统发育；藜芦科

重楼属L.植物全球共有约30余种，主要分布于我国西南地区，有药用记载的有11种[1]。其中滇重楼Smith var.(Franch.) Hand. -Mazz.和华重楼Smith var.(Franch.) Hara，是《中国药典》2020年版收载的品种[2]。由于长期的掠夺式采挖，重楼属植物资源遭到了毁灭性的破坏，多个物种已濒临枯竭[3-4]，加强该属植物种质资源的保护和相关基础研究迫在眉睫。毛重楼H. Léveillé为重楼属植物，主要分布在云南、四川和贵州，以根茎入药，具有清热解毒、平喘止咳、消肿散瘀，常用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、咳嗽、蛇虫咬伤、跌扑伤痛等病症[5]。现代研究表明，毛重楼含有螺甾烷型、呋甾烷型、五环三萜型等多种皂苷类化合物[6-8]，具有抗肿瘤、抗病毒等重要药用价值[9]。目前，有关毛重楼的研究主要集中在栽培、遗传多样性、化学成分和药效学研究等方面[5,8,10-11]。此外，Song等[12]虽报道了毛重楼的叶绿体全基因组，但未对该植物的基因序列特征、功能与分类、密码子组成等进行研究，且未与重楼属其他植物叶绿体基因组进行比较，限制了对其遗传背景、种质资源保护及系统发育进化等方面的认识。鉴于此，本研究对毛重楼、峨眉重楼var.H. X. in, H. Zhang、滇重楼3个重楼属物种的新鲜叶片进行了测序，并对毛重楼叶绿体基因组结构特征和系统进化进行了解析，同时比较了上述3个物种的叶绿体基因组特征差异，以期为研究毛重楼优良品种选育、种质资源保护和植物系统进化发育奠定科学基础。

1 材料

样品的新鲜叶片采自云南省永平县龙门乡种质资源圃（N99°53′，E25°54′），经大理大学段宝忠教授鉴定为毛重楼H. Léveillé（标本号YN20200820A6）、峨眉重楼var.H. X. in, H. Zhang（标本号YN20191003B2）和滇重楼Smithvar.(Franch.) Hand. -Mazz.（标本号YN20191002B4）健康叶片装入取样袋后带回实验室，用无菌水冲洗数次，晾干后置于−80 ℃冰箱保存备用。

2 方法

2.1 基因组DNA的提取和测序

取毛重楼、峨眉重楼和滇重楼的新鲜叶片，采用植物基因组DNA试剂盒（TIANGEN公司，北京）提取总DNA。采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。检测合格后的总DNA利用Illumina HiSeq X Ten平台进行建库测序。原始序列采用NGS QC ToolKit进行质控。原始数据提交到GenBank，登录号MW694831。

2.2 叶绿体基因组的组装与注释

以峨眉重楼叶绿体全基因组序列（NC_050052）为序列延伸种子，在Linux系统中运行脚本。使用NOVOPlasty （V.3.8.3）对原始测序数据进行组装。采用Circlator （V.2.0.1）[13]软件，检测reads映射的覆盖度和各contigs的连接处，检验组装的正确性。注释、编辑和校正采用Geneious（V.9.1.4）进行。叶绿体基因组环状示意图采用OGDRAW在线工具绘制[14]。

2.3 重复序列和密码子使用分析

采用CPGAVAS2（http://47.96.249.172:16019/ analyzer/home）进行重复序列和密码子使用分析[15]。其中，MISA用于发现微卫星序列分析[16]，参数阈值设置为：单、双、3、4、5、6，核苷酸参数为10、6、5、5、5、5；TRF软件用于串联重复序列分析[17]，重复单元大小设定≥7；VMATCH软件用于分析散布重复序列[18]；GC含量和密码子使用偏好采用EMBOSS（v6.3.1）[19]中的Cusp程序计算获得。

2.4 基因组比较分析

使用IRscope可视化工具，比较毛重楼、滇重楼和峨眉重楼叶绿体基因组4个区域边界的差异。并采用mVISTA对其进行全基因组比对分析。

2.5 系统进化分析

为探讨毛重楼的系统位置，本研究按照《中国植物志》百合科分类系统，从NCBI下载了百合科下22条物种的叶绿体基因组序列，包括广义重楼属植物15条，藜芦属植物5条和贝母属L.植物2条。同时选择与百合科亲缘关系较近的菝葜科（Smilacacea）菝葜L.和白背牛尾菜Miq.作为外类群，构建最大似然（maximum likelihood，ML）系统发育树。具体步骤：采用MAFFT（V.7.0）[20-21]进行全基因组比对，然后使用RAxML（V.8.2.11）软件，核苷酸替代模型设置为GTR＋I＋G（Bootstrap 1000），具体参数为：“raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -f a -N 1000 -m GTRGAMMA -x 551314260 -p 551314260-o Smilax_china_NC_ 049022，Smilax_nipponica_NC_ 049024 -T 20”。

3 结果与分析

3.1 叶绿体基因组结构

利用Illumina HiSeq X Ten测序，去除接头和低质量的数据后，共得到32 817 588条长度约为150 bp的序列。利用NOVOPlasty进行组装，经注释后得到毛重楼的叶绿体基因组。结果表明，毛重楼叶绿体基因组总长163 819 bp，G/C含量为37.05%，A/T含量为62.95%，有明显的AT偏向性。基因组呈双链环状（图1），具有典型的4分区域结构，包括1个大单拷贝区（large single-copy，LSC）、1对反向互补重复区（inverted repeats，IR）和1个小单拷贝区（small single-copy region，SSC），其大小分别为84 173、33 296、13 054 bp。此外，LSC、IR和SSC区域的GC值存在一定的差异，碱基组成结果见表1。由表1可看出，IR区的G/C含量最高（39.73%），其次是SSC区（35.70%）及LSC区（32.16%），其可能原因是IR区含有高GC含量的rRNA基因[22]。

图1 毛重楼叶绿体基因组图谱

表1 毛重楼叶绿体基因组碱基组成

3.2 叶绿体基因组功能及分类

毛重楼叶绿体基因组共包含113个基因，其中编码蛋白基因、rRNA基因与tRNA基因的数量分别为79、4、30个。根据其功能可以把它们分为4大类：分别是与光合作用有关的基因、复制有关的基因、未知功能的蛋白质基因，以及成熟酶基因（）、囊膜蛋白基因（）等其他基因。在这些基因中，有10个蛋白质编码基因（、、、、、、、、、）、7个tRNA编码基因（、、、、、）和4个rRNA编码基因（、、、）位于IR区。对毛重楼叶绿体基因内含子进行统计分析，发现共有22个基因含有内含子，其中仅有4个蛋白质编码基因（、、、）含有2个内含子，其余18个基因只有1个内含子（表3）。

表2 毛重楼叶绿体基因组基因列

表3 毛重楼叶绿体基因中内含子的位置和长度

3.3 散在重复序列、串联重复序列及SSR分析

散在重复序列以值＜1×10−4为阈值进行筛选，结果显示重复单元以散在方式分布于基因组内，包括回文重复序列26条、正向重复序列23条，其长度均为110～180 bp。串联重复序列按照总长度大于20 bp，且重复单元间相似性≥90%进行筛选，结果显示共有15个串联重复序列。简单重复序列（simple sequence repeat，SSRs）分析表明，共有80个SSRs位点。其中包括60个单核苷酸重复基序，13个二核苷酸重复基序，3个三核苷酸重复基序，2个五核苷酸重复基序和2个六核苷酸重复基序，未发现四核苷酸重复基序。SSR的类型以A/T为主，共有59个；其次为AT/AT，共有12个（表4）。

3.4 叶绿体基因组密码子使用分析

毛重楼叶绿体基因组密码子使用频次统计结果显示，共有41 893个密码子（图2）。在这些密码子中，异亮氨酸（Leu）为频次最高的氨基酸，编码4766次，占10.21%；密码子总数＜2000次的氨基酸有半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）、组氨酸（His）、甲硫氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、谷氨酰胺（Gln）、精氨酸（Arg）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、终止子（TER），其中编码频次最低的氨基酸为半胱氨酸（Cys），仅编码603次，占总密码子的1.29%。这与蒙古韭Regel、金铁锁W. C. Wu & C. Y. Wu等陆生植物观察到的趋势一致[23-24]。图2显示了毛重楼叶绿体基因组所有蛋白质编码基因的20个氨基酸和终止密码子的密码子个数。

表4 毛重楼叶绿体基因组SSRs类型及数量

3.5 IR边界变化分析

研究显示，毛重楼叶绿体基因组共存在4个边界，分别是IRB-SSC、IRB-LSC、IRA-SSC、IRA-LSC。所选的3个重楼属植物叶绿体基因组相对保守（图3），3个物种的IRB-LSC边界均位于，且该基因在IRB区域长度均为6 bp。IRB-SSC的边界与存在间隙，其中该基因在毛重楼中扩张，距SSC区仅3 bp，而峨眉重楼与滇重楼均为21 bp。所有物种的IRA- SSC边界均位于内，该基因相对保守长度均为2222 bp。此外，IRA-LSC边界均与基因存在着58～59 bp的间隙。

图2 毛重楼蛋白质编码基因中20个氨基酸和终止密码子的密码子含量

图3 重楼属3种植物叶绿体基因组的LSC、IRs和SSC边界区域的比较分析

3.6 基因组序列变异分析

尝试与NCBI中重楼属部分物种进行比较，但发现NCBI数据库的多条重楼属物种和基因缺失达5300 bp，尚不清楚是物种问题还是测序深度所造成，因此，采用了本课题组装拼接的序列进行比对，以期更进一步理解他们之间的差异。全局比对采用在线基因组比对工具mVISTA，以项目组已发表的峨眉重楼叶绿体基因组（NC_050052）为参照，对毛重楼和滇重楼（NC_052909）叶绿体基因组序列进行比对分析（图4）。结果显示，3条叶绿体基因组序列中非编码区变异高于保守的蛋白编码区域，LSC区、IR区变异明显大于SSC区，rRNA基因高度保守，几乎没有变异。由图可见，变异较大的基因有F、L-UAA、A和D，其他基因的保守程度非常高，绝大多数的基因相似度都在90%以上。3个重楼属植物的基因间区，如T-UGU-L-UAA、-D、L-CAU-2、F-V、E-UUC-T-GGU、S-GCU-G-UCC、8-等，其基因间区变异均大于基因区。此外，毛重楼变异相对较大，如Q-UUG和2基因，以及K-L、H-L和D-A基因间区。这些位点为毛重楼的分子鉴定提供了新的位点资源。

3.7 毛重楼叶绿体基因组系统发育分析

为确定毛重楼的系统位置，基于24条序列构建的ML系统进化树见图5。从图5可见，2个外类群物种独立为一支；毛重楼与蚤休属L.的禄劝花叶重楼等聚成一支，再与延龄草属L.聚成一支，之后与北重楼属L.聚为一支，这3支在《被子植物APG分类法IV》（APG IV）分类系统均归属为延龄草亚科（Subfam. Trillioideae A. Gray），表明相较北重楼属而言，毛重楼与延龄草属的亲缘关系更近；延龄草亚科（Subfam. Trillioideae）与藜芦亚科（Subfam. Melanthioideae Eaton）聚为一支归属于藜芦科。值得一提的是，百合科贝母属与藜芦科分布在不同的进化支上，支持率为100。在之前的研究中，学术界对重楼属植物的系统进化关系一直存在着较大争议[25-27]。如李恒[26]和Dumortier[28]提出重楼属与延龄草属二者构成一个单系类群，亲缘关系最近，应归属于延龄草科（Trilliaceae）；而在《中国植物志》中重楼被归属于百合科（Liliaceae）。本研究结果表明，相较藜芦科，毛重楼与百合科的关系较远，基于叶绿体基因组的系统进化分析，支持将毛重楼从百合科中独立，归属为藜芦科，这一结果与前人的研究结果一致[29]。从属下等级来看，基于叶绿体基因组的ML树显示，广义重楼属被分为5个类群，分别是蚤休组Sect.、五指莲组Sect、黑籽组Sect.、日本重楼Sect.和北重楼组Sect.，这一结果与前人的研究结果存在一定的分歧，如Franchet认为重楼属分为Sect.[30]和蚤休组2个组；而Hara[31]和Takhtajian[32]学者则认为重楼属应分为北重楼组、日本重楼组和侧膜组3个组[31-32]。李恒[26,33]则将其分为侧膜亚属和中轴亚属，而后再分成海南重楼组Sect.、蚤休组、禄劝花叶重楼组Sect.、球药隔重楼组Sect.、五指莲组、黑籽组、日本重楼组和北重楼组。鉴于重楼属植物分类的分歧，从叶绿体基因组系统发育的角度来看，重楼属植物应分为5个类群较为恰当。

图4 毛重楼与相关重楼属植物叶绿体基因组全局比对图

图5 基于叶绿体全基因组序列构建ML系统进化树

4 讨论

本研究完成了毛重楼叶绿体基因组的测序、组装和注释，并对其结构、GC含量等进行了分析。研究表明毛重楼具有典型的环状DNA分子，且具有保守的4分状结构，全长163 819 bp，与本课题前期组装的同属植物滇重楼、峨眉重楼等叶绿体基因组大小相似[34-35]，其GC含量为36.5%，共编码125基因，其中14个蛋白编码基因含有内含子。此外，在该基因组中存在一些未知功能的基因，如和，到目前为止，功能尚未清楚的基因虽仍在大多数被子植物中存在，但在重楼属植物的叶绿体基因组中已完全消失。本研究从毛重楼叶绿体基因组中分别共检测到80个SSR，共发现15条串联重复序列及49条散在重复序列。这些重复序列可为重楼属物种分子标记开发，物种或产品鉴定提供理论依据。

基于叶绿体基因组的ML进化树显示，广义重楼属[26]被分为蚤休组、五指莲组、黑籽组、日本重楼组和北重楼组5个类群，其中毛重楼与蚤休组聚为一支，相较于北重楼组，毛重楼与蚤休组的亲缘关系最近，建议将毛重楼归属为蚤休组。此外，相较于百合科，毛重楼与藜芦科藜芦属亲缘关系更近，支持将蚤休属归于藜芦科的观点。本研究表明叶绿体基因组可在物种水平上有效解决重楼属的系统进化问题。毛重楼叶绿体基因组的组装和序列分析，为后续开展群体遗传学和遗传多样性研究奠定了科学基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 刘玉雨, 徐福荣, 范敏, 等. 重楼属植物在少数民族医药中的应用 [J]. 世界科学技术—中医药现代化, 2019, 21(3): 449-456.

[2] 中国药典 [S]. 一部. 2020: 23.

[3] 方海兰, 夏从龙, 段宝忠, 等. 基于DNA条形码的中药材种子种苗鉴定研究: 以重楼为例 [J]. 中药材, 2016, 39(5): 986-990.

[4] 鄢连和, 姜程曦, 朱美晓. 畲族珍稀濒危特有药用植物资源现状分析 [J]. 中草药, 2014, 45(22): 3351-3355.

[5] 黄贤校, 高文远, 谷克仁, 等. 毛重楼的化学成分研究 [J]. 中草药, 2009, 40(9): 1366-1369.

[6] 刘杨. 南重楼和毛重楼的化学成分研究 [D]. 西安: 中国人民解放军空军军医大学, 2018.

[7] 黄圆圆, 刘大会, 彭华胜, 等. 15种重楼属植物中8种甾体皂苷的含量测定 [J]. 中国中药杂志, 2017, 42(18): 3443-3451.

[8] 刘江. 滇产7种重楼属药用植物主要成分含量分析及止血、镇痛药效学研究 [D]. 大理: 大理大学, 2017.

[9] 刘潇潇, 王磊, 隆颖, 等. 毛重楼的化学成分研究 [J]. 中国中药杂志, 2014, 39(16): 3107-3111.

[10] 辛本华. 重楼属植物遗传多样性研究与品质评价分析 [D]. 雅安: 四川农业大学, 2012.

[11] 张海珠, 赵飞亚, 陶爱恩, 等. 基于成分-活性整体相似性的重楼替代资源筛选 [J]. 中草药, 2018, 49(18): 4366-4373.

[12] Song Y, Xu J, Zhang Y J,. Characterization of complete chloroplast genome of traditional Chinese medical plantsand its phylogenetic positions [J]., 2019, 4(2): 3822-3823.

[13] Hunt M, Silva N D, Otto T D,. Circlator: automated circularization of genome assemblies using long sequencing reads [J]., 2015, 16: 294.

[14] Greiner S, Lehwark P, Bock R. OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW) version 1.3.1: Expanded toolkit for the graphical visualization of organellar genomes [J]., 2019, 47(W1): W59-W64.

[15] Shi L C, Chen H M, Jiang M,. CPGAVAS2, an integrated plastome sequence annotator and analyzer [J]., 2019, 47(W1): W65-W73.

[16] Beier S, Thiel T, Münch T,. MISA-web: a web server for microsatellite prediction [J]., 2017, 33(16): 2583-2585.

[17] Benson G. Tandem repeats finder: A program to analyze DNA sequences [J]., 1999, 27(2): 573-580.

[18] Kurtz S, Choudhuri J V, Ohlebusch E,. REPuter: the manifold applications of repeat analysis on a genomic scale [J]., 2001, 29(22): 4633-4642.

[19] Langmead B, Trapnell C, Pop M,. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome [J]., 2009, 10(3): R25.

[20] Katoh K, Rozewicki J, Yamada K D. MAFFT online service: Multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization [J]., 2019, 20(4): 1160-1166.

[21] Kuraku S, Zmasek C M, Nishimura O,. Leaves facilitates on-demand exploration of metazoan gene family trees on MAFFT sequence alignment server with enhanced interactivity [J]., 2013, 41(web server issue): W22-W28.

[22] 吴茜, 姜梅, 陈海梅, 等. 旋覆花、湖北旋覆花和线叶旋覆花的叶绿体基因组比较分析和系统发育研究 [J]. 药学学报, 2020, 55(5): 1042-1049.

[23] 王媛媛, 杨美青. 蒙古韭叶绿体基因组密码子使用偏好性分析 [J]. 分子植物育种, 2021, 19(4): 1084-1092.

[24] 高亚芳, 刘莹莹, 杨从卫, 等. 金铁锁叶绿体基因组序列及其系统发育分析 [J]. 中草药, 2019, 50(22): 5532-5536.

[25] Song Y, Wang S J, Ding Y M,. Chloroplast genomic resource of Paris for species discrimination [J]., 2017, 7(1): 3427.

[26] 李恒. 重楼属植物 [M]. 北京: 科学出版社, 1998: 269.

[27] 赵志勇, 高文远, 黄贤校, 等. 重楼属植物分类学研究进展 [J]. 药物评价研究, 2010, 33(3): 244-246.

[28] Dumortier B C .[Ｍ].:, 1829: 126.

[29] 杨丽芳. 重楼属叶绿体系统发育基因组学与生物地理学研究 [D]. 昆明: 云南大学, 2019.

[30] Franchet A. Plantarum sinensium ecloge secunda [J]., 1898, 12(17/18): 253-264.

[31] Hara H. Variation in Paris polyphylla Smith, with reference to other Asiatic species [J]., 1969, 10(10): 141-180.

[32] Takhtajan A. A revision of(Trilliaceae) [J]., 1983, 35(3): 255-270.

[33] 李恒. 重楼属的分类研究 [J]. 植物研究, 1986, 6(1): 109-144.

[34] Fan M, Liu J, Wang J,. The first complete chloroplast genome sequence of Parisvar. emeiensis, a rare and endangered species [J]., 2020, 5(3): 2172-2173.

[35] Guan X, Yang Q S, Wang S,. Chloroplast phylogenomic analysis provides insights into the evolution ofsp. nov [J]., 2021, 6(2): 346-348.

Complete chloroplast genome of: characterization and phylogeny

JIANG Yuan1, 2, YANG Qing-shu1, 2, WANG Jing1, 2, YANG Cheng-jin3, HUANG Lin-fang2, YANG Yan3, DUAN Bao-zhong1

1. College of Pharmaceutical Science, Dali University, Dali 671000, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China 3.Yunnan Baiyao Group Traditional Chinese Medicine Resources Co., Ltd., Kunming 650504, China 4. Yunnan Provincial Academy of Science and Technology, Kunming 650051, China

To obtain the complete chloroplast genome information and to estimate phylogenetic relationships among.The Illumina platform was used to sequence the complete chloroplast genome ofThe bioinformatics software were used to assemble, annotate and characterize the complete chloroplast genome of. RAxML was used to reconstruct a maximum-likelihood (ML) phylogenetic tree.The complete chloroplast genome ofwas 163 819 bp, containing inverted repeated of 33 296 bp each, a large single-copy region of 84 173 bp, and a small single-copy region of 13 054 bp. A total of 113 genes were identified including 79 protein-coding, 30 tRNAs, and 4 rRNAs. Phylogenetic analysis indicated thatpresented a closer relationship with Melanthiaceae than Liliaceae.The IR region variability was significantly inferior to LSC and SSC. Besides, phylogenetic analysis revealed thatwas closely related to.

H. Lév.; chloroplast genome;L.; phylogeny; Melanthiaceae

R282

A

0253 - 2670(2021)13 - 4014 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.024

2020-12-05

国家自然科学基金项目（31860080）；云南省重大科技专项（202002AA100007）；大理大学创新团队项目（ZKLX2019318）；云南省院士专家工作站（宋经元，2021-1）

江 媛（1997—），硕士研究生，研究方向为中药资源与鉴定。E-mail: yjiang@yntcm.ac.cn

段宝忠，教授，研究方向为中药资源与鉴定。Tel: (0872)2257411 E-mail: bzduan@126.com

[责任编辑 时圣明]