DNA分子标记技术在菠菜遗传育种中的应用研究进展

彭枫　张莹　陈珂　戴雨柔　李亚兵　蔡晓锋

摘  要： 简述了DNA分子标记的种类和特点，综述了分子标记技术在菠菜遗传育种中的主要应用，包括：性别鉴定、抗病菠菜育种、高产优质菠菜培育、物种亲缘关系和遗传多样性研究，及分子标记辅助育种等方面的研究进展，并对分子标记技术的发展和应用前景进行了展望.

关键词： 分子标记; 菠菜; 遗传育种

中图分类号： S 636.1    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2021）02-0237-06

Research progress of DNA molecular markers in spinach genetic breeding

PENG Feng¹， ZHANG Ying²， CHEN Ke¹， DAI Yurou¹， LI Yabing¹， CAI Xiaofeng^1*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China;2.Department of Plant Science and Technology， Shanghai Vocational College ofAgriculture and Forestry， Shanghai 201699， China）

Abstract： The types and characteristics of DNA molecular markers were briefly introduced in this paper，while itemphatically illustrated sex test，disease-resistant spinach breeding，high-yield and high-quality spinach breeding，genetic relationship and diversity and molecular marker-assisted selection in spinach genetic breeding.Then，the future development and application prospects of DNA molecular markers were prospected.

Key words： molecular marker; spinach; genetic breeding

菠菜（Spinacia oleracea L.）为苋科藜亚科菠菜属植物^[1]，是以绿叶为主要产品器官的1～2年生草本植物.由于其具有适应性较强、适应性广、易储存、供应期长、栽培方式多样等优点，可实现周年供应，是一种重要的经济蔬菜作物.菠菜可鲜食亦可加工，是中国分布最普遍、群众食用最广泛的蔬菜之一，同时也是中国出口创汇的主要蔬菜之一^[2].菠菜在中国的种植面积仅次于大白菜、青花菜、甘蓝等蔬菜作物，位居第4^[3].

在常规育种工作中，研究人员基于植株的表型性状对特定植物进行定向选择，但选择效率低、耗时费力.为加速植物的育种改良进程，分子标记应运而生.分子标记是以个体间遗传物质DNA的多态性为基础的遗传标记，它相对于其他的遗传标记具有准确性高、信息量大、检测手段简单迅速、重现性好等优点^[4].近年来，随着分子生物学技术的不断发展，分子标记技术也在不断完善进步.随着分子标记技术的不断成熟，其在园艺作物育种中的应用范围也越来越广泛.

本文在简述DNA分子标记的种类和特点的基础上，重点阐述了分子标记技术在菠菜抗病性研究、高产优质菠菜培育、品种鉴定和性别鉴定、物种亲缘关系和遗传多样性研究，以及分子标记辅助育种等方面的研究现状，并对分子标记技术的发展和应用前景进行了展望.

1  DNA分子标记的种类和特点

DNA分子标记技术兴起于20世纪80年代，随着分子生物学技术的不断发展和完善，到21世纪初，已经成为应用十分广泛而且比较成熟的技术.根据DNA检测方法的不同，可以将DNA标记分为4类：1） 基于分子杂交的分子标记技术，主要有限制性片段长度多态性（RFLP）和数目可变串联重复多态性（VNTR）;2） 以PCR为基础的分子标记技术，包括随机引物PCR和特异引物PCR，主要有隨机扩增多态性DNA（RAPD）、序列标签位点（STS）、简单序列重复（SSR）、序列特征化扩增区域（SCAR）、单引物扩增反应（SPAR）、DNA单链构象多态性（SSCP）、抗病基因同源序列法（RGAP）;3） 限制性内切酶和PCR相结合的技术，主要有扩增片段长度多态性（AFLP）和酶切扩增多态性序列（CAPS）;4） 以单个核苷酸变异为核心的标记，主要有单核苷酸多态性（SNP）标记.不同的DNA分子标记技术各有其特点和适用领域，明确常见DNA分子标记的特点，有利于选用合适的分子标记方法进行实验研究^[5].

DNA分子标记具有许多优点：一是可以利用植物各个发育时期的个体组织以及器官做材料进行检测，不受环境条件的限制;二是检测数量多，可以覆盖整个基因组;三是标记比较稳定、多态性高，这些优点使得DNA分子标记技术能够得到广泛的应用^[6].目前在菠菜遗传育种研究中应用较广泛的有RAPD，AFLP，RFLP，SSR和SNP等.

2  分子标记在菠菜遗传育种中的应用

2.1 近缘种属间遗传进化关系和品种间遗传多样性

分子标记技术已广泛地应用于物种系统演化及种间亲缘关系分析，这类研究有助于弄清一些物种种属的分类地位和起源，同时也有利于指导育种工作^[7].

吴娅妮等^[8]利用AFLP标记技术对110份来源不同的菠菜种质进行遗传多样性分析，种质间的遗传相似系数为0.64～0.87，与地理来源有很高的一致性，全部供试种质可分为2类：欧美、西亚、东亚及中国北方种质聚为一类，部分日本种质和中国的南方种质聚为另一类.梅燚等^[9]利用形态学分类法和AFLP分子标记技术对45份菠菜育种材料的遗传多样性和亲缘关系进行了研究，聚类分析结果表明：第一类群主要以欧美资源和有欧美血统的杂交种为主，第二类群主要以日本资源和含有日本血统的杂交种为主，第三类群以中国本土品种为主.聚类结果与形态学的分类结果基本一致，而且聚类结果与地域来源和形态特征有一定的对应关系.AFLP标记能很好地从分子水平揭示菠菜资源的亲缘关系.由亲缘关系推测中国的南、北方菠菜种质可能有着不同的起源.除此之外，SNP分子标记也广泛应用于菠菜分类中.SHI等^[10]利用SNP标记将343份来源于世界各地的菠菜种质资源分为2类，即亚洲种质类群和欧美种质类群.XU等^[11]利用SNP标记将120份菠菜种质资源分为2类，即东亚、中国种质类群和西亚、欧美及非洲种质类群.

近年来，SSR标记越来越多地被用于菠菜遗传多样性研究和品种鉴定中.赵瑞丽等^[12]利用聚丙烯凝胶（PAGE）电泳法对33份菠菜种质资源进行了指纹图谱构建和遗传多样性分析，筛选出的27对多态性明显、带型稳定的引物，共扩增出109个多态性位点，平均每对引物约4个.经多态性位点分析，用7对高多态性引物构建了能够区分33份菠菜种质的指纹图谱，为供试材料的鉴别提供参考.G?L等^[13]将85个筛选出来的标记应用于来自世界各地的48个菠菜种质，产生389个等位基因，其中89%具有多态性，结果表明：新开发的SSR标记适合评估菠菜种质的遗传多样性和种群结构.这些标记还揭示了基于地理起源的种质聚类，远东种质分离明显，与来自波斯、土耳其、欧洲和美国的种质相比，总体上遗传多样性最丰富.LI等^[14]用41对SSR引物對收集自中国的43个菠菜品种进行了遗传多样性研究，结果表明：41个标记的平均多态性信息含量值为0.43，代表中等水平，菠菜品种遗传多样性较低.

2.2 高产优质菠菜育种

产量和品质是菠菜品种选育的重要指标.菠菜的产量构成因素主要有株型、单株叶数、叶片大小、单株质量等;菠菜的品质包括外观品质，例如叶色、叶面光泽度等，以及内在品质，例如草酸、硝酸盐及维生素C含量等^[15].菠菜育种过程中应选择外观品质好、内在品质优的品系或品种.除此之外，耐抽薹也是菠菜的重要育种目标.菠菜是典型的长日照蔬菜，在长日照（日照时间大于13 h）条件下，即使不经受低温，也可分化花芽并抽薹开花.在春茬、夏茬和早秋菠菜栽培过程中，如果栽培的品种不耐抽薹，经常会出现早期抽薹现象，造成巨大的生产损失.通过分子标记辅助选择有利于高产优质菠菜育种.

MA等^[16]对323种来自美国农业部（USDA）的菠菜种质资源的3个叶片性状（平滑度、叶柄色和叶缘形状）进行了关联性分析，通过基因分型技术（GBS）进行SNP鉴定，发现5个SNPs与叶片平滑度有关，7个SNPs与叶缘形状有关，14个SNPs与叶柄颜色有关，这些SNP标记有助于叶片性状的筛选.CHITWOOD等^[17]运用GBS筛选的SNPs对288种来自USDA的种质资源进行了基因分型，确定了3个SNP标记（AYZV02001321_398，AYZV02041012_1060，AYZV02118171_95）与抽薹性相关;8个SNP标记（AYZV02014270_540，AYZV02250508_2162，AYZV02091523_19842，AYZV02141794_376，AYZV02077023_64，AYZV02210662_2532，AYZV02153224_2197，AYZV02003975_248）与株高相关;4个SNP标记（AYZV02188832_229，AYZV02219088_79，AYZV02030116_256，AYZV02129827_197）与菠菜直立性相关.

矿物质元素浓度的单核苷酸多态性标记对于支持菠菜分子育种是非常重要的.QIN等^[18]对菠菜进行全基因组关联研究（GWAS），并在USDA-GRIN菠菜种质资源中鉴定了与矿物质元素相关的SNP标记.鉴定出45个SNP标记为与13种矿物质元素（B，Ca，Co，Cu，Fe，Mg，Mn，Mo，Na，Ni，P，S，Zn）的浓度密切相关;两个SNP标记与K浓度弱相关.SHI等^[19]对310种菠菜基因型进行了草酸浓度相关性分析，并鉴定与之相关的SNP标记，结果表明：草酸含量是由多个因素控制的数量性状基因，每个基因在被测菠菜中均具有较小的作用.关联分析发现6个SNP标记（AYZV02031464_116，AYZV02031464_117，AYZV02031464_95，AYZV02283363_2707，AYZV02287123_2830，AYZV02296293_852）与草酸浓度相关.这些SNP分子标记的确定有助于标记辅助选择培育高产优质的菠菜品种^[17].

2.3 抗病育种

菠菜在中国可以实现周年栽培^[20]，但在长期、固定栽培生产环境中，菠菜病害也愈加严重，将分子标记运用于菠菜抗病研究中，有利于培育抗病菠菜.

中国农业科学院蔬菜花卉研究所^[21]利用其构建的遗传连锁图谱，结合关联分析技术，将菠菜霜霉病抗性位点RPF1定位到菠菜3号染色体的1.72 Mb區域内，进一步通过SLAF-Seq开发的分子标记将RPF1定位到0.89 Mb区域内.该区域包含14个R基因，并鉴定出3个抗菠菜1～7，9，11，13和15号霜霉病生理小种的候选基因（Spo12729，Spo12784和Spo12903），根据这3个基因在感病和抗病菠菜材料之间的差异位点，开发了3个分子标记，为后期进行菠菜霜霉病分子标记抗性鉴定提供保障.SHI等^[22]通过对273种菠菜基因型进行叶斑病抗性分析，结合关联分析，发现8个SNP标记（AYZV02052595_115，AYZV02052595_122，AYZV02057770_10404，AYZV02129827_205，AYZV0-2152692_182，AYZV02180153_337，AYZV02225889_197，AYZV02258563_213）与叶斑病抗性有很强的相关性.SHI等^[23]还利用相同的方法，鉴定出5个SNP标记（AYZV02052595_108，AYZV02112284_14543，AYZV02123399_146，AYZV02164612_331，AYZV02170942_274）与黄萎病抗性相关，这些SNP标记将成为菠菜分子育种中，通过标记辅助选择抗叶斑病和黄萎病的工具.

2.4 性别鉴定

菠菜系雌雄异株植物，开花前无法判定性别.由于菠菜性别不同，经济价值不同（雄株叶片肥大、长势好、上市早，比雌株高产），对其性别的早期鉴定尤显重要^[24].利用分子标记技术探讨菠菜不同性别植株基因组之间的差异，筛选与性别相关的分子标记，不仅为菠菜性别的早期鉴定提供技术手段，且为研究雌雄异株植物的性别决定和分化机制、克隆与性别相关的基因提供了参考.

杨金华等^[25]利用ISSR扩增体系在雌、雄DNA混池中筛选出一个能扩增出约1 200 bp的雌性连锁标记I62，并将其转化为稳定性和特异性更好的SCAR标记，该标记在雌株中可以扩增出1 176 bp的特异条带，而在雄株中没有其条带.邓传良等^[26]设计了7对EST-SSR引物，在适合的PCR反应体系下，分别以雌、雄菠菜DNA基因组为模板，对设计的EST-SSR引物进行筛选，结果显示：以EST序列HS097148设计的一对引物从菠菜雌雄基因组中扩增出一条雄性特异的条带，表明通过菠菜EST-SSR引物获得菠菜性别相关特异序列是可行的.刘丹丹等^[27]采用SRAP-BSA法筛选到3个与性别基因X/Y紧密连锁的SRAP标记：SRAP4.3，SRAP5.7和SRAP9.5，并将SRAP5.7和SRAP9.5转化为SCAR标记（S5.7，S9.5），将SRAP4.3转化为dCAPs标记（D4.3）.其中SCARP标记S5.7，S9.5与Y基因共分离，dCAPs标记D4.3与X/Y基因紧密连锁，遗传距离为0.3 cm.分子标记S5.7和S9.5在菠菜雄株里可以分别扩出126 bp和119 bp的特异性条带，在雌株里没有条带.dCAPs标记D4.3在雌、雄株中都可以扩出179 bp的条带.用AluI内切酶酶切，雌株只有1条带，而雄株有2条带，分子标记鉴定结果与表型鉴定结果一致，说明这3个分子标记可以用于分子标记辅助选择育种.

3  展望

分子标记技术虽然仅发展了20余年，但已渗透于整个生物研究界.在农业研究中，它作为一种重要的育种手段已充分显示出独特的优越性，目前分子标记辅助育种技术已在蔬菜遗传育种中广泛应用.由于菠菜的重要性不及粮食作物，分子标记技术在菠菜上的应用较少，分子标记技术在菠菜研究中的应用具有广阔的前景.另一方面，分子标记技术仍然为一种新的技术，应与传统的育种技术有机结合.分子标记技术的检测结果和效应最终要到大田试验中验证.随着分子生物学的发展，将分子标记育种技术与传统育种很好地结合起来，必将对菠菜的遗传育种起着巨大的推动作用.

随着菠菜基因组的测序完成，利用全基因组关联分析，结合传统遗传定位将筛选获得更多与耐热、性别调控、抗霜霉病等性状有关的分子标记，为分子标记辅助选择育种奠定坚实的基础，也为挖掘菠菜分子遗传信息和机制提供重要契机，将大大促进菠菜基础研究和应用研究的进展.因此，进一步加快菠菜分子标记的开发，筛选与菠菜性型、抗病及其他性状紧密连锁的分子标记，进行分子标记辅助选择育种、多位点聚合育种及分子设计育种，也是未来菠菜育种的发展方向^[28].

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（责任编辑：顾浩然，包震宇）