重组甜味蛋白Monellin在E. coli中的表达条件及其对ICR小鼠血糖的影响

杨冬梅，王晨璐，刘嘉健，方越，葛瑛，韩淳致，曹荣月*

(1.中国药科大学 生命科学与技术学院，南京 211198；2.澳门大学 国际中华医药研究院，澳门 00853)

糖尿病是一种严重的慢性病，过去几十年中，随着人们生活水平的不断提升，糖尿病的病例数和患病率都在稳步上升[1]。目前，糖尿病无法根治，患者的饮食控制对治疗效果起着至关重要的作用。糖尿病患者需要避免摄入高糖、高脂、高蛋白的食物，尤其是糖类食品对高血糖、肥胖症患者有着强烈的升血糖作用，影响患者的治疗效果[2]。糖类物质是引起甜味感觉的主要物质[3]，随着糖尿病患者的增加和低糖饮食人群数量的上升，为了满足消费者对甜味物质的需求，研究人员把目光转向非糖类甜味剂。现今市场上的非糖类甜味剂主要有3类[4]，分别为人工合成非营养型甜味剂、糖醇类甜味剂、营养性非糖甜味剂[5-6]。目前人工合成的非营养型甜味剂作为常用食品添加剂被广泛地应用在各类食品中，虽然人工合成甜味剂对人没有直接的危害,但其安全性问题尚无定论，而且过量使用可能会影响人体的代谢，对机体功能造成危害[7-9]。甜味蛋白作为一种新型营养性非糖甜味剂，近些年的研究日渐广泛。不同于摄入蔗糖等被分解为葡萄糖，甜味蛋白摄入后被分解为氨基酸，没有直接且快速的升血糖作用，因此对于高血糖、易肥胖者具有重要的应用意义。目前已有8种天然甜味蛋白被发现和研究，其中Monellin最初是从西非森林植物DioscoreophyllumcumminsiiDiels红色浆果中分离提纯得到的一种甜味蛋白[10]，天然Monellin由45个氨基酸残基和50个氨基酸残基的两条多肽链通过非共价键连接在一起组成[11]。目前Monellin已经被美国食品和药物管理局 (FDA)批准为“公认安全”的食品添加剂。现有研究表明，按照不同的评估标准，Monellin的相对甜度是蔗糖的800～2000倍不等，可用作甜味剂和增味剂[12]。与人造甜味剂相比，Monellin拥有一些重要的优势，它可以用作非碳水化合物甜味剂，开发成为糖尿病患者的安慰性甜味剂或甜酵母片[13]，其安全性高并且不会将非天然代谢物引入人体，也不会干扰氨基酸库的平衡，另外，Monellin蛋白基因相对容易克隆，可以引入到食品和饮料工业中使用的许多微生物中,具有巨大的市场潜在应用价值。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种及质粒

实验室保存的E.coliBL21(DE3)菌种，pET28Monellin质粒：苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 实验动物

ICR清洁级雄鼠：扬州大学比较医学中心，生产许可证:SCXK(苏)2017-0007。

1.1.3 实验试剂

SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit、蛋白非预染MarkerⅡ、IPTG：生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常见市售分析纯试剂。

1.1.4 仪器设备

HL-2恒流泵 上海沪西分析仪器有限公司；2000/2000c NanoDrop分光光度计 Thermo Fisher Scientific公司；Beidi-1000E超声波细胞破碎仪 南京贝帝实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1E.coliBL21(DE3)电转感受态的制备

在超净工作台中，将E.coliBL21(DE3)菌种的单克隆挑至灭过菌的LB试管中，活化8 h。按照1∶100的比例接种至20 mL LB培养基中，过夜活化。按照1∶100的比例接种至500 mL LB培养基中，当OD600值达到0.5时，迅速将菌液冰浴，并摇晃菌液使其快速冷却。待菌液冷却后，将菌液分装至预冷的离心杯中离心20 min。倒掉上清液后，用 250 mL预冷的10%甘油溶液轻轻重悬，离心20 min。弃上清液，用10 mL 预冷的10%甘油溶液轻轻重悬，离心。于沉淀中加入1 mL预冷的GYT溶液轻轻重悬，混匀，测定波长在600 nm处的OD值。用GYT溶液将剩余的细胞重悬至细胞浓度在2×1010～3×1010个细胞/mL。用1.5 mL EP管分装，于-80 ℃保存。

1.2.2 重组子的转化

将2 μL公司合成的重组产物加入制备的电转感受态细胞中，轻轻混匀，然后将其全部吸入预冷的0.2 cm电转杯中，插入电转仪。电击完成后，加入1 mL SOB培养基混匀，全部转入新的1.5 mL EP管中，在37 ℃摇床中孵育 2 h。离心孵育后的菌液，吸去900 μL上清液，用200 μL微量移液器轻轻吹悬底部菌体，吸出20 μL扩培到试管，其余的菌液均匀涂布到含有KNA抗性的平板上，倒置过夜培养。

1.2.3 阳性克隆菌株的获得

将阳性单菌落用牙签挑下至已灭菌的含有3 mL LB培养基的10 mL试管中，培养12 h后收集菌体，提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳，观察核酸条带位置，判断转化是否成功。

1.2.4 生长曲线

取活化后的菌种BL21(DE3)-pET28a Monellin按1∶100的比例接种于加有KNA的LB培养基锥形瓶中，于摇床培养24 h，以未接种菌体的培养基为空白对照，每隔一段时间测定培养基的OD600值，以光密度(OD600值)为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。根据生长曲线确定加入诱导剂的时间。

1.2.5 乳糖诱导和IPTG诱导的浓度梯度与时间梯度对比实验

进行浓度梯度、时间梯度的乳糖诱导与IPTG诱导的探索实验，通过SDS-PAGE电泳的条带，比较不同诱导条件下目的蛋白的表达效果，从而得出诱导的最佳条件。

1.2.5.1 菌种接种

取活化后的菌BL21(DE3)-pET28a Monellin(1∶100)接种于加KNA的LB培养基试管中，于摇床培养至OD600值约为0.6时加入诱导剂。

1.2.5.2 乳糖和IPTG最适诱导时间

取经过摇床培养至OD600值为0.6的试管3支，3支均取样记为0时样品，其中一支试管不加入任何物质，作为空白对照；一支试管中加入IPTG使其终浓度为0.9 mmol/L；向第三支试管中加入乳糖使其终浓度为8 g/L，继续摇床培养，每间隔1 h取一次样，空白组取培养终点样，乳糖和IPTG每支试管均取8个时间点的样。

1.2.5.3 乳糖和IPTG最适诱导浓度

取14支经摇床培养至OD600值为0.6的试管，分为两组，每组7支。向第一组各管中加入乳糖溶液使其终浓度分别为0，4，6，8，9，10，11 g/L，培养4 h后收集菌液。向另一组各管中加入IPTG溶液，使其终浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mmol/L，培养5 h后收集菌液，进行全菌SDS-PAGE电泳，对条带进行分析，以获得乳糖和IPTG的最佳诱导浓度。

1.2.5.4 诱导剂的选择

对乳糖最佳诱导浓度和IPTG最佳诱导浓度下的菌液进行SDS-PAGE电泳，以判断目的蛋白在何种诱导剂的诱导下表达量更高。

1.2.6 大规模诱导培养

将BL21(DE3)-pET28a Monellin按照 1∶100 的比例接种到含有KNA抗性的 LB液体培养基中，当其OD600值为0.6时加入IPTG母液使其终浓度为0.9 mmol/L，诱导5 h，通过SDS-PAGE验证目的蛋白的表达。

1.2.7 甜味蛋白的提取纯化

将诱导表达后的菌液进行低温离心，随后重悬菌体。于超声波细胞破碎仪中破碎细胞，使蛋白游离出来。将超声后的溶液离心10 min，收集上清液。取上清液与超声沉淀分别制作蛋白电泳样，确认目的蛋白的存在形式。

1.2.8 镍柱亲和层析

利用Monellin蛋白带有His标签采用镍柱亲和层析的方法对其进行纯化，依次上60，100，200，500 mmol/L咪唑洗脱液进行梯度洗脱。流穿液、平衡液、洗脱液分别制样，进行SDS-PAGE电泳，通过电泳结果判断是否有未结合镍柱的蛋白需要二次洗脱，以及蛋白被何种浓度的洗脱液洗脱下来，然后对含有大量蛋白的洗脱液进行透析，透析液为去离子水。

1.2.9 甜味阈值的判定

本实验采用感官评定人员对甜味蛋白的稀释溶液进行双盲感官评定的方式来检测甜味蛋白的甜味。将透析得到的蛋白进行冻干，在实验开展前将上述蛋白样品浓度配制成10，25，50，75，100，125，150，175，200 μg/mL，对照蔗糖浓度为20 mg/mL。选择20名身体健康、味觉正常的志愿者，男女各一半，年龄在20～40岁之间。志愿者先品尝作为对照的蔗糖溶液，再由低浓度到高浓度品尝甜味蛋白溶液。在实验过程中，志愿者不知溶液的浓度，每次含入2 mL的样品溶液，大约20 s后吐出并用去离子水漱口，给出分值后间隔几分钟再进行下一浓度的评估。将每个浓度所得分数求平均值，将分数最接近2.0的样品浓度定为甜味阈值。选择分数最接近1.0的样品浓度，对照蔗糖浓度与其比值即为相对甜度。

1.2.10 蔗糖和甜味蛋白对ICR小鼠血糖的影响

Raben等[14]及Fujita等[15]采用短期甜味刺激的方式研究人工甜味剂对机体能量的影响，得出人工甜味剂对机体葡萄糖代谢的无效性。由此推断摄入甜味蛋白的小鼠血糖浓度低于摄入葡萄糖的小鼠，高于或近似于饮水组的小鼠血糖浓度。长期暴露的甜味刺激实验中，非能量型人工甜味剂与能量型蔗糖一样，低甜度能够增加机体葡萄糖耐受性，高甜度反复刺激机体时则会降低机体血糖的耐受性[16]。

通过感官评价，25 μg/mL该人工合成的甜味蛋白甜度与对照组20 mg/mL蔗糖甜度相近。取25只RIO型健康正常生长期小鼠，饥饿处理12 h后，随机分成5组，测定最低血糖浓度，记为0时血糖浓度。以25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液、去离子水和20 mg/mL蔗糖溶液对各组小鼠分别灌胃，检测灌胃后0.5，1，1.5，2，3，4，5 h的血糖值，绘制血糖时间曲线，比较各个时间点血糖和血糖时间曲线的曲线下面积(AUC)。

2 结果与讨论

2.1 BL21(DE3)-pET28a Monellin菌种的获得

图1 质粒图谱及电泳结果Fig.1 The plasmid diagram and electrophoresis results注：A为pET28a-MNEI 质粒图谱；B为阳性单菌落提取质粒核酸电泳结果：M表示250 bp DNA Ladder；1表示提取的质粒。

根据Monellin的核苷酸序列合成含有His标签的质粒，质粒图谱见图1。将KNA筛选呈阳性的单菌落培养后提取质粒，进行核酸电泳，结果见图1中B。核酸电泳在5600 bp处有条带，证明电转化成功，获得目的菌种BL21(DE3)-pET28a Monellin，保存获得菌种。

2.2 生长曲线

重组菌的生长曲线见图2，取其OD600值为0.6时加入诱导剂，即其经摇床培养5 h后加入诱导剂。

图2 重组BL21(DE3)-pET28a Monellin菌的生长曲线Fig.2 The growth curve of recombination BL21(DE3)-pET28a Monellin strains

2.3 乳糖和IPTG最适诱导时间

图3 乳糖和IPTG最适诱导时间的确定Fig.3 Determination of the optimal induction time of lactose and IPTG注：A表示IPTG诱导时间；B表示乳糖诱导时间；M表示蛋白非预染Marker Ⅱ，1～8分别表示诱导0，1，2，3，4，5，6，7 h。

由图3可知，诱导时间对Monellin的表达量有明显的影响，经过Image J处理分析可知IPTG最佳诱导时间为5 h，乳糖的最佳诱导时间为4 h。

2.4 乳糖和IPTG最适诱导浓度

图4 乳糖和IPTG最适诱导浓度的确定Fig.4 Determination of the optimal induction concentration of lactose and IPTG注：A表示IPTG诱导表达Monellin；B表示乳糖诱导表达Monellin；M表示蛋白非预染Marker Ⅱ；IPTG浓度1～7分别表示0，0.2，0.4，0.6，0.8，0.9，1.0 mmol/L；乳糖浓度1～7分别表示0，4，6，8，9，10，11 g/L。

由图4可知，对不同诱导物浓度的菌液进行SDS-PAGE电泳发现诱导物浓度对Monellin的表达量有明显的影响，经过Image J处理分析可知IPTG的最佳诱导浓度为0.9 mmol/L，乳糖的最佳诱导浓度为10 g/L。

2.5 诱导剂的选择

乳糖和IPTG都能诱导大肠杆菌表达目的蛋白。以乳糖作为诱导物，诱使乳糖操纵子启动蛋白表达，但乳糖会被细胞分解利用，随着诱导时间增长，诱导效率会降低。IPTG凭借与乳糖相似的构造，同样能够诱使蛋白表达启动，但细胞不分解IPTG，IPTG可以长久而持续地发挥效用[17]。

图5 诱导剂的选择Fig.5 The selection of inducers注：M表示蛋白非预染Marker Ⅱ，1表示10 g/L乳糖诱导，2表示0.9 mmol/L IPTG诱导。

由图5可知，对10 g/L乳糖诱导4 h和0.9 mmol/L IPTG诱导5 h的菌液进行SDS-PAGE电泳，经过Image J处理分析可知10 g/L乳糖诱导的Monellin表达量低于0.9 mmol/L IPTG诱导的Monellin表达量，因此，相对于乳糖，选择IPTG作为诱导剂。

2.6 Monellin在大肠杆菌中的表达形式

图6 Monellin的表达形式Fig.6 Monellin's expression form注：M表示蛋白非预染Marker Ⅱ，1表示超声上清，2表示IPTG诱导后全菌，3表示超声沉淀。

由图6可知，对诱导的蛋白进行SDS-PAGE电泳，经过图像分析可知，Monellin主要存在于破碎细胞的上清液中，在沉淀中仅有少部分Monellin蛋白，故只需对上清液中的Monellin进行纯化处理。

2.7 镍柱纯化结果

图7 Monellin的镍柱纯化结果Fig.7 Monellin's nickel column purification results注：M表示Marker，1表示60 mmol/L咪唑洗脱蛋白收集液，2表示100 mmol/L咪唑洗脱液，3表示200 mmol/L咪唑洗脱液，4表示500 mmol/L咪唑洗脱液，5表示蛋白收集液，6表示纯化前沉淀，7表示纯化前上清液。

由图7可知，100，200 mmol/L咪唑洗脱下了目的蛋白，100 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白含量明显比200 mmol/L咪唑洗脱下的多。60 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白大多是杂蛋白，500 mmol/L洗脱下的杂蛋白含量较低，无明显条带。因此，下一步透析对象即为100 mmol/L和200 mmol/L的咪唑洗脱液。

2.8 双盲法评价甜味蛋白的甜度

选择20位味觉正常的人口尝甜味蛋白并进行感官评价，他们一致认为Monellin甜蛋白在最初几秒不产生甜味觉，而后产生强烈甜味，但口感不如蔗糖，吐出后有干涩感。且浓度为25 μg/mL的甜味蛋白溶液甜度近似蔗糖对照溶液，即该甜味蛋白甜度等于800倍蔗糖甜度。100 μg/mL的蛋白浓度其分数最接近2.0，视为甜味阈值。

表1 评价不同浓度Monellin甜度平均值Table 1 Evaluation of the average sweetness of various concentration of Monellin

2.9 蔗糖和甜味蛋白对小鼠血糖的影响

图8 给予甜味蛋白、蔗糖、去离子水后小鼠血糖浓度变化Fig.8 Changes in blood glucose concentration in mice after giving sweet protein＇ sucrose and deionized water注：A表示去离子水、20 μg/mL蔗糖溶液、25 μg/mL Monellin溶液灌胃后血糖值变化曲线；20 mg/mL蔗糖溶液与25 mg/mL Monellin溶液血糖值比较，“**”表示p<0.01,“*”表示p<0.05；25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液灌胃后血糖值变化曲线，各组间没有显著性差异(p>0.05)。

由图8中A可知，给予蔗糖后小鼠血糖总体水平明显高于给予去离子水组，给予Monellin后小鼠血糖水平高于去离子水组小鼠血糖水平明显低于蔗糖组小鼠血糖水平。

由图8中B可知，对3组小鼠分别给予25，37.5，50 μg/mL Monellin灌胃后，小鼠血糖水平没有显著性差异，即在一定范围内，小鼠血糖水平不受Monellin浓度变化的影响。

3 结论

实验由已知的具有Monellin相关基因的大肠杆菌诱导表达甜味蛋白Monellin。通过光电比浊计数法测得实验条件下工程菌的对数生长期，在其OD600值约为0.6，即培养时长约为5 h后加入诱导剂。通过不同浓度的IPTG诱导与乳糖诱导表达Monellin，并设置取样时间，通过SDS-PAGE比较蛋白的表达量，从而测得实验条件下乳糖诱导该工程菌的最佳浓度是终浓度10 g/L，最佳时长是4 h，IPTG诱导该工程菌的最佳浓度是终浓度0.9 mmol/L，最佳诱导时长是5 h。对两种不同诱导剂诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳比较后发现，IPTG的诱导效果更好。所以最终采用0.9 mmol/L的IPTG作为诱导剂大规模诱导BL21(DE3)-pET28a Monellin菌种，表达Monellin后亲和层析提纯蛋白，将纯化后的Monellin冻干后稀释，进行双盲实验，以重量计，该重组Monellin蛋白甜度相当于800倍的蔗糖甜度，其甜味阈值为100 μg/mL。向各组小鼠分别灌入25，37.5，50 μg/mL Monellin溶液、去离子水、20 mg/mL蔗糖溶液，与蔗糖相比，Monellin没有显著升高血糖的作用，并且在一定范围内，Monellin对血糖的影响不随其浓度的改变而发生变化。

4 展望

天然甜味蛋白与基因工程以及蛋白质工程的联系日益密切，有关研究也愈加成熟。甜味蛋白Monellin虽然具有甜度高、引发糖类相关疾病的可能性小等优点，但是由于其对热敏感，在酸碱条件下容易变性，导致Monellin难以实际应用于食品生产行业[18]。目前已经有研究人员[19]通过基因工程技术培养出了Monellin的突变体E23A 和 C41A，它们的热稳定性强且甜味阈值较低，具有广阔的商业化前景，为甜味蛋白Monellin的研究提供了新的思路与依据。随着基因工程技术的进步和对甜味蛋白Monellin研究的深入，不同位点的氨基酸对甜味蛋白Monellin的影响将更加明朗，刘洋等[20]为了确认影响Monellin甜度的关键残基，将位于循环区的残基进行诱变分析后发现，连接天然Monellin两条单链的亲性环L23是甜味蛋白Monellin的一个甜度决定位点，为Monellin的分子设计提供了有效指导。本实验室接下来将找到更符合工业化生产需要的突变体蛋白，从而全面地发挥Monellin的价值，以满足市场对其产量和稳定性的需求。