云南切梢小蠹幼虫表皮碳氢化合物与龄数的相关性*

张梦蝶 钱路兵 泽桑梓 杨 斌 李宗波

(1.西南林业大学生物多样性保护学院 云南省森林灾害预警与控制重点实验室 昆明 650224； 2.云南省林业和草原有害生物防治检疫局 昆明 650224)

昆虫表皮碳氢化合物(Cuticular hydrocarbons, CHCs)是指广泛存在于昆虫上表皮中一类由长链烷烃和烯烃所组成的混合物，其性质稳定，加之成分和含量在种间种内的差异性，即使是复合种、近缘种、隐形种、同种个体的不同发育阶段或社会品级等也有明显差异，对于昆虫化学分类、物种演化、信息通讯与调控、胚后发育、农林害虫治理及其益虫利用等研究均具有重要的启示作用(Pageetal., 1997; Blomquistetal., 2010; Yoonetal., 2012; Derstineetal., 2018; Bersonetal., 2019; 李群臣等, 2019)。云南切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)隶属于鞘翅目象虫总科(Curculionoidea)小蠹科(Scolytinae)切梢小蠹属(Tomicus)，又称为纵坑切梢小蠹或云南松纵坑切梢小蠹，是一种为害云南松的蛀干害虫，自20世纪80年代暴发危害以来，累积致死的活立木蓄积量超过20万hm2，严重影响了云南松林的可持续发展和生态安全(李丽莎 等, 1997; Kirkendalletal., 2008; 沈绍伟等, 2018)。当前，虽然已有一套关于云南切梢小蠹的综合治理措施，例如喷洒杀虫剂和生物制剂、释放天敌昆虫、信息素和寄主气味或饵木诱杀、非寄主气味干扰、营造混交林等(李浩然等, 2000; 王海林等, 2002; 李双成等, 2003; 叶辉等, 2006; 岳锋等, 2011; 王大伟等, 2015; Wuetal., 2019)，但仍无法控制该虫扩散蔓延的趋势，这说明在云南切梢小蠹治理体系中存在着缺失环节，特别是关于云南切梢小蠹的发育生物学特征。但对于蛀干、潜叶、土壤中等营隐蔽式生活和危害的昆虫，其发育生物学难以直接观察，特别是幼虫的龄数不易确定； 而通过人工室内饲养导致幼虫生活环境的改变，常常引起龄数出现较大变化，从而无法精确了解寄主幼虫发育龄数及发育进度。由于这种基础研究的缺失，会极大地降低害虫科学预测预报的准确性，随之降低有害生物的综合治理效能(陈辉, 2002; Castexetal., 2018)，如迁飞高峰措置(Peak shift displacement)使得喷洒的真菌制剂杀虫效果不佳，或者释放的天敌昆虫无法及时找到合适寄主(王海林等, 2002; 叶辉等, 2006)。同时，随着全球化进程的加快，国际交往日益频繁，并考虑到全球气候变化的大背景(Castexetal., 2018; Liuetal., 2019)，该虫的扩散及危害潜能会被放大，产生的生态破坏性将难以估量。本研究旨在通过林间大量抽样调查，运用形态数据测定自然条件下云南切梢小蠹幼虫的龄数，结合不同龄级幼虫的表皮碳氢化合物进行定性定量分析，为深入了解云南切梢小蠹生物学特征及其科学治理该虫危害提供依据。

1 材料与方法

1.1 幼虫的获取与判定

云南切梢小蠹幼虫采集于曲靖市沾益区九龙山林场(103°7′15″ E，25°0′35″ N)，为该区域内林木害虫的优势种群，主要在树干中上部蛀干繁殖(沈绍伟等, 2018)。于2017年11月至2019年5月，分批次带回新蛀入或已在树干内发育的云南切梢小蠹幼虫。为了更准确地区分龄数，将位于坑道两侧的卵(60粒)置于培养皿中的湿润滤纸上，室温条件下保湿培养，待其孵化后作为1龄幼虫(图1A)，而老龄幼虫以蛹室形成且有木屑封堵为判断依据(图1B)。将每次采集的云南切梢小蠹幼虫分别放入75%的乙醇溶液中保存，共收集到各龄幼虫1 426头。参考象虫总科幼虫龄数的划分标准(Mizelletal., 1979; Castaeda-Vildzolaetal., 2016)，用蔡氏体式镜(V20，German)对各个幼虫进行拍照，用Image J(Version 1.62，https:∥imagej.nih.gov)测量其头壳宽和体长，并用扫描电镜(Zeiss sigma 300, German)观察不同龄数幼虫的微观形态，测其上颚长与宽。

图1 云南切梢小蠹初孵幼虫和末龄幼虫的判定Fig. 1 Determination of larval instars in Tomicus yunnanensis using the freshly hatched larvae from eggs and last larvae blocked in the pupal cellsA1: 坑道两侧的卵 Eggs on the both sides of gallery ; A2: 初孵幼虫 The freshly hatched larvae from eggs; B1: 封堵在蛹室(虚线)内的老龄幼虫 The last instar larvae are blocked by the wood chips (the arrow) in the pupal cell (the dashed line); B2: 末龄幼虫 Morphology of the last instar larvae.

1.2 幼虫表皮碳氢化合物的提取与分析

采用浸提法对云南切梢小蠹不同龄数幼虫的表皮碳氢化合物进行提取(Pageetal., 1997; Blomquistetal., 2010)。首先将从木段中解剖出来的幼虫立即置入-20 ℃冰箱内杀死，超声波清洗后(冰浴)，依据头壳宽确定龄数，每龄重复15次，每次测定60只，用400 μL正己烷洗涤2次，第1次10 min(静置5 min，震荡1 min，再静置3.5 min，震荡30 s)，第2次静置1 min，然后将混合液放置在2 mL棕色试剂瓶内，-20 ℃保存待用。在GC-MS(Agilent 7890A-5975C，USA)分析以前，先将样品用氮气吹干，滴入少量正己烷，接着加入内标化合物正十四烷(n-C14)和正十六烷(n-C16)各2 μL(2 ng·μL-1)，定容至50 μL。接着取1 μL定溶液从进样口注入，质谱柱型号为极性HP-5 MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。升温程序： 起始温度为40 ℃，以10 ℃·min-1升温至150 ℃，以5 ℃·min-1升温至300 ℃，保持10 min。高纯度氮气作为运载体，流速为1 mL·min-1，进样口温度250 ℃，柱前压100 kPa，进样采用不分流模式。MS条件： EI源，70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，质量扫描范围全扫描。采用NIST 08谱库检索法、峰面积标准化法(Aitchison, 1986)、科瓦特指数法(Marquesetal., 2000)及其与C8—C40烷烃混合标准品(500 μg·mL-1，AccuStandard，USA)比对进行鉴定(计算公式如下)，化合物含量根据内标的量计算。

Zip= ln[Aip/g(Ap)]。

式中：Zip为转换后待鉴定化合物的峰面积；Aip为待鉴定化合物的峰面积；g(Ap)为各组分色谱峰面积的几何均值。

KI=100n+100 ×[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]。

式中：KI为科瓦特指数；n为待鉴定化合物前面正构烷烃的碳原子数；x为待测化合物碳原子数；tR(x)为保留时间；tR(n)和tR(n+1)分别为待鉴定化合物色谱峰前一个和后一个正构烷烃的保留时间。

1.3 数据处理与分析

所有的数据统计分析均在开源软件R(Version 3.5.1，https:∥cran.r-project.org/)中进行，制图用GraphPad Prism(Version 8.0.2)完成。对测定的头壳宽度，首先进行频数分布分析，间隔最小设置为0.02 mm，接着再用体长、上颚长和宽等进行验证，以此确定云南切梢小蠹幼虫龄数。龄数划分后，进一步根据测定指标的均值、标准误差、变幅、变异系数、Brooks指数、Crosby指数等确定最佳龄数，若变异系数小于20%、Crosby指数小于10%，则表明分龄指标合理(Castaeda-Vildzolaetal., 2016)，接着用回归分析拟合龄数与体长、头壳宽间的关系，用Tukey氏多重比较法对比各龄幼虫指标的差异性。对于表皮碳氢化合物，利用FactoMineR软件包进行主成分分析(Lêetal., 2008)，选用极大方差法旋转因子，并基于相关系数矩阵计算主成分得分系数，提取特征值大于1的成分，最后再用RandomForest软件包进行化合物贡献量分析(Mccormicketal., 2014)，提取基尼指数(MeanDecreaseGini)大于2的成分； 用Kruskal-Wallis test进行各龄数幼虫化合物总量和关键化合物量的多重比较。

2 结果与分析

2.1 云南切梢小蠹幼虫的龄数

幼虫头壳宽度频次分布具有3个界线明显的峰区，而每个峰区中又有明显的峰值，分别位于0.50、0.825和1.04 mm处(图2)，因幼虫发育过程中需解除外骨骼限制而产生蜕皮，每次蜕皮幼虫即会突长一次，进入下一龄，所以从频次图上可以推测云南切梢小蠹幼虫共有3龄。进一步来看，幼虫头壳宽度与龄数间的变异幅度是比较小的(7%～14.6%)，且Crosby指数小于0.1，并经统计检验和回归分析均达到了极显著水平(P<0.000 1； 表1)，表明将云南切梢小蠹幼虫龄数划分为3龄是合理准确的。扫描电镜观察显示云南切梢小蠹幼虫共有12体节，其表面微观形态，包括前额心形盾及其表面刚毛数量和排列形式、额须上的味觉感器、上颚及其齿数、内唇等均没有不同，仅长度与宽度有所增加(图3； 表1)。当用体长、上颚长和宽进行龄数拟合时，尽管这些指标均可将云南切梢小蠹幼虫划分为3龄，统计检验和回归分析也显示有显著差异(体长：F=3 383.6，P<0.000 1； 上颚长：F=740.82，P<0.000 1； 上颚宽：F=91.395，P<0.000 1； df=1)，但幼虫体长的变异系数超过20%，2龄和3龄幼虫的上颚宽度间差异不显著(表1)。

图2 云南切梢小蠹幼虫头壳宽度频次分布Fig. 2 Frequency distribution of the head-capsule widths of the larval T. yunnanensis

表1 云南切梢小蠹幼虫各项测量指标的分龄与统计①Tab.1 Measurement and statistical analysis of the four various indexes for the larval instars of T. yunnanensis

图3 云南切梢小蠹不同龄数幼虫的微观形态Fig. 3 Micrograph of larval instars of T. yunnanensisA—C: 1～3龄幼虫 The instar numbers of the larvae from the first instar to the third instar; 字母后的数字1～3分别示整体、头壳背面和腹面 The numerals behind the capital letter indicate the ventral view of the larval body, the dorsal and ventral view of larval head capsule, respectively.

2.2 幼虫表皮碳氢化合物种类与组成

共从云南切梢小蠹幼虫中鉴定出19种表皮碳氢化合物，主要为正链烷烃、支链烷烃和烯烃3类烃类物质，含量分别为每虫4.41 ng± 0.67 ng、0.26 ng ±0.04 ng和1.22 ng± 0.18 ng，各烃类物质在不同龄级幼虫中分布相差较大(表2)。其中，正链烷烃以正二十五烷和正二十七烷为代表，占比分别为55.02% ± 8.20%和21.37% ± 3.19%； 支链烷烃中以13-甲基-二十九烷含量最高，占整个支链烷烃的94.04%±14.02%； 烯烃类以1, 21-二十二烷二烯为主，占比为63.03%±0.39%。

表2 云南切梢小蠹不同龄数幼虫的表皮碳氢化合物种类、含量及其主成分分析与随机森林判定①Tab.2 Mean relative content of cuticular hydrocarbon and their results of principal component scores and random forest analysis on the larval instars of T. yunnanensis

2.3 不同龄数幼虫表皮碳氢化合物对比

云南切梢小蠹初孵幼虫(1龄幼虫)的表皮碳氢化合物有8个，碳数介于10～19之间，C10—C14和C15—C19各占近50%； 2龄幼虫有8个化合物，碳数为10～29，其中C20—C24和C25—C29为主要成分，分别占19.98%和71.11%； 而老熟幼虫(3龄幼虫)则有17个，以C25—C29和C30—C35为主，分别占61.94%和12.74%(表2)。随着龄级增加，幼虫表皮碳氢化合物的含量分别为每虫2.32 ng±0.59 ng、44.40 ng±11.49 ng和280.75 ng±72.48 ng，龄级间有着显著差异(χ2=39.13，P<0.000 1)(图4)。主成分分析显示第一主成分和第二主成分联合贡献率为81.7%，其中正十二烷(7.46%)、正十三烷(7.44%)、2,6,11-三甲基-十二烷(3.48%)、正十八烷(7.67%)等12种化合物超过第一主成分贡献量，正二十三烷(13.32%)和正二十五烷(12.78)是第二主成分的重要贡献者，不同龄数幼虫的化合物分离程度高，龄数与龄数间无重叠区域(表2、 图5)。在幼虫表皮碳氢化合物构成的重要性方面，随机森林分析显示2,6,11-三甲基-十二烷、正十五烷、正十九烷、正二十三烷和正二十五烷5种化合物具有较大的重要性(表2)。其中，2,6,11-三甲基-十二烷仅存在于1龄幼虫，而正十五烷在3龄幼虫中相对含量仅为0.1%，为一种微量化合物。在不同龄级幼虫上，这5种化合物的含量上有着显著差异(P<0.000 1)，2,6,11-三甲基-十二烷为1龄幼虫的标识性物质，而正二十三烷和正二十五烷可作为2龄和3龄幼虫的识别物(表2、图6)。

图5 云南切梢小蠹不同龄数幼虫表皮碳氢化合物的主成分得分Fig. 5 Scores plot of principal components extracted from cuticular hydrocarbons of the larval instar of T. yunnanensis

图6 云南切梢小蠹不同龄数幼虫表皮中5种重要碳氢化合物的含量Fig. 6 Mean contents of five important compounds of cuticular hydrocarbons on the larval instar of T. yunnanensis

3 讨论

昆虫表皮碳氢化合物是昆虫化学分类中采用时间最久的生物学指标(Bioindicators)(Jackson, 1970; Blomquistetal., 2010; 李群臣等, 2019)，如早在20世纪70年代，Jackson (1970)就发现碳数为23～26的正二十三烷、顺-9-二十三烯、3-甲基-二十三烷、11-甲基-二十三烷、13-甲基-二十五烷等5种长链烷烃可轻松将3种大蠊(Periplaneta)区分开。随着化学分析技术及其多元统计分析方法的大量应用，发现表皮碳氢化合物除可区分蜚蠊目外，还可用来区分鞘翅目(Pageetal., 1997)、鳞翅目(Hay-Roeetal., 2007)、双翅目(Barbosaetal., 2017)、半翅目(Yoonetal., 2012)、等翅目(Blomquistetal., 2010)、同翅目(Raboudietal., 2005)、膜翅目(Soaresetal., 2017)、直翅目(Brozaetal., 2000)等众多昆虫，并且一些表皮碳氢化合物反映了其胚后发育状态(Zhuetal., 2006; Blomquistetal., 2010; Kuoetal., 2012; Yoonetal., 2012)。例如，渐变态的点蜂缘蝽(Riptortuspedestris)卵的标识物是3-甲基-二十七烷，若虫是正二十九烷，成虫是正二十七烷、正三十一烷、13,17-/15,19-二甲基-三十三烷(Yoonetal., 2012)； 而全变态的红颜金蝇(Chrysomyarufifacies)幼虫期主要是正烷烃类，随龄级增加短链碳氢化合物含量呈指数级减少，代表性物质是正二十五烷和正二十九烷(Zhuetal., 2006)。不仅如此，形态极为相似的近似种鳞翅目夜蛾科的棉铃虫与烟青虫2种幼虫表皮碳氢化合物组分也出现区别，并且材料为5～6龄幼虫碳数分布24～32与云南切梢小蠹幼虫3龄幼虫主要碳数分布25～35极为相似(高明媛等, 1999)。从云南切梢小蠹幼虫表皮碳氢化合物的结果来看，不同龄级幼虫的化合物组成差别较大，特别是对分类有重要意义的2,6,11-三甲基-十二烷、正十五烷、正十九烷、正二十三烷和正二十五烷这5种化合物，良好的分离效果可能反映了其在龄级中的动态变化，也可能与总含量的指数级增加有关(y=e0.086 5x-0.629，R=0.911)(图4)。尽管一些化合物含量极低，但其在化合物整体组成中不可或缺，显示了一些新的成分分析方法，如随机森林、非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)、典型辨别分析(canonical discriminant analysis，CDA)等，对于探索多元数据背后所隐含生物学含义具有重要的作用(Mccormicketal., 2014)。另一方面，云南切梢小蠹幼虫在树干内发育，且每一个幼虫均有各自独立的坑道进行取食，考虑到树皮提供的保护及相对高含水量的环境，防止体内水分流失应不是营隐蔽生活昆虫所面临的问题，更多应该与其生理活动和代谢水平有关(Blomquistetal., 2010)，正如1龄幼虫的烷烃类化合物仅有8个，且碳数均小于20，而随着龄级的增加，老熟幼虫有17种，而碳数也达到最大的35个，其发育进度中化合物种类与碳数增加的结果与栖境相似昆虫在发育进度的变化相符(Zhuetal., 2006; Kuoetal., 2012; Yoonetal., 2012)，但与裸露生活的点蜂缘蝽、叶甲、胡蜂、齿小蠹成虫等差别较大(Pageetal., 1997; Yoonetal., 2012; Zhangetal., 2014; Soaresetal., 2017)。另外，昆虫表皮碳氢化合物链长每增加一个仲碳原子(-CH2-)，其熔点会提升2 ℃，进而会增加幼虫体壁的坚硬程度，对温度的容忍能力亦会提升(Menzeletal., 2017)，这也很好地解释了随着昆虫龄数的增加，包括云南切梢小蠹在内的众多昆虫的表皮碳氢化合物链长为何增加的现象。

用幼虫表皮碳氢化合物可轻松地将云南切梢小蠹3个龄级幼虫区分开，比用头壳宽度、体长、上颚长与宽的分离效果更好(表1、图5)。昆虫的生长周期表现出明显的周期性，特别是鳞翅目(Godinetal., 2002)、鞘翅目(Mizelletal., 1979; Castaeda-Vildzolaetal., 2016)、双翅目(Richardietal., 2013)、膜翅目(Vilhelmsen, 2011)等幼虫头壳骨化程度高且相对稳定的昆虫，身体各部的长宽会按指数级增长，局部的生长状况可以指示整个虫体的生长状况。根据云南切梢小蠹幼虫的4个测定指标，虽然均可将其划分为3龄，但因各龄幼虫体长和上颚宽重叠度较大，加之颚的长与宽测定相对困难，以它们作为龄数划分依据，存在诸多的限制条件，因此，出头壳宽度仍不失是一个良好的形态指标。但是，林间大量抽样过程中仍会出现明显错误，特别是头壳宽为0.60～0.675 mm和0.9～0.94 mm这些介于龄数之间的虫体样本，而用幼虫表皮碳氢化合物能够明显克服这些缺点，特别是用基尼指数大于2的5种化合物或者对龄期有重要标识的2,6,11-三甲基-十二烷、正二十三烷和正二十五烷。未来，将幼虫表皮碳氢化合物的研究结果与便携式气质联用仪、电子鼻、表面增强拉曼光谱等快速分析鉴定方法相结合(Castexetal., 2018; Turlingsetal., 2018)，会实现云南切梢小蠹发育进度的实时监测，为提升预测预报精度和综合治理该虫危害奠定基础。

4 结论

云南切梢小蠹幼虫表皮碳氢化合物由正链烷烃、支链烷烃和烯烃3类19种烃类物质组成，从1龄幼虫至3龄幼虫，化合物数量从8个增加到17个，碳数从10增加到35，含量从每虫0.139 ng±0.007 ng增至16.845 ng±1.366 ng，呈指数级递增。幼虫表皮碳氢化合物可明显将不同龄数的幼虫区分开，龄数与龄数间无重叠，划分标准显著优于头壳宽、体长、上颚长与宽等形态指标法。2,6,11-三甲基-十二烷、正十五烷、正十九烷、正二十三烷、正二十五烷具有较大的重要性，含量上亦有显著差异，其中2,6,11-三甲基-十二烷可用于1龄幼虫的标识性物质，正二十三烷和正二十五烷可识别2龄和3龄幼虫，这将为研究云南切梢小蠹幼虫发育进度及监测预报提供科学依据。