新型材料固定化氧化还原酶研究进展

王世珍， 刘凯泷， 王世燕， 江亮， 段凌暄， 熊雨， 季哲惠

(厦门大学化学化工学院， 福建 厦门 361005)

0 引言

氧化还原酶催化生命体内各种氧化还原过程， 不仅可用于制备手性化合物、 开发体外诊断试剂和酶传感器， 也可为生物电催化合成平台的构建奠定基础[1]. 氧化还原酶由于其结构复杂， 具有辅酶和底物等多个结合位点， 且往往由多个亚基组成， 因此在反应过程中容易失活. 提高氧化还原酶的稳定性主要有酶分子结构改造和固定化两种途径.

氧化还原酶固定化主要通过创造生物相容性好的微环境和限域空间抑制酶侧链基团的热振动以提高酶的稳定性. 基于新型材料的固定化新方法可拓展在电驱动催化、 非水相体系以及高温高压等反应条件的生物催化领域的应用[2]. 对于氧化还原酶的固定化， 在材料选取和固定化方法选择等需多方面考虑， 包括酶固定化载体的化学组成、 界面性质以及微观结构等对酶稳定性、 电子传递、 底物和产物扩散过程的影响. 目前广泛使用的载体材料分为高分子材料、 碳材料、 聚合物-无机复合材料、 金属-有机框架材料(metal organic framework, MOF)等(见图1). 这些材料具有稳定性好、 机械强度高、 化学惰性、 孔隙率高、 比表面积大等优势， 并可通过表面可控修饰， 获得生物相容性好的固定化载体.

图1 固定化酶材料分类Fig.1 Classification of materials for enzyme immobilization

导电材料固定化氧化还原酶可用于生物传感器和生物电催化合成等领域. 通过设计、 功能修饰获得具有导电性能的生物相容性材料， 进一步构建酶电催化反应器， 可实现高效生物电催化， 推动绿色生物制造发展. 复合导电材料主要是导电性材料， 如石墨烯、 碳纳米管等碳材料， 以及金属氧化物、 导电MOF与高分子形成复合材料. Mazurenko等[3]从促进电子直接传递的角度进行阐述， 综述了酶电极表面修饰材料的新进展. Kornienko等[4]综述了酶电极界面导电材料设计和修饰的新进展.

本研究侧重总结导电固定化载体的设计， 通过调控氧化还原酶的微环境， 提高酶的稳定性、 催化效率和电子传递速率(见图2). 固定化材料表界面改造与蛋白工程改造相结合, 可强化氧化还原酶分子与电极界面的电子传递， 可为构建高效、 绿色的酶催化反应提供思路.

图2 氧化还原酶固定化方法Fig.2 Strategies of oxidoreductase immobilization

1 碳材料与高分子复合材料固定化

碳基材料具有高导电性、 导热性以及良好的生物相容性等优点， 因而在固定化酶领域备受青睐. 碳纳米材料的表面多为介观结构， 且机械性能优异、 比表面积大， 能够为酶固定化提供结合位点[5]， 不仅具有较高的吸附能力， 同时能够进行多种功能化修饰， 是酶固定化的理想载体. 碳材料微观形貌各异， 电子传递性能和生物相容性也有较大差异. 其中导电碳材料， 如石墨烯及其衍生物、 碳纳米管和碳布等是研究热点， 被广泛作为纳米载体应用于酶电极、 生物燃料电池和生物电催化等各个领域.

1.1 石墨烯

石墨烯是一种二维片层材料， 单层厚度为0.335 nm， 其结构是由碳原子以sp2杂化形成的稳定的六元环， 最早由英国科学家在2004年通过机械剥离的方式获得. 由于其在机械性能、 稳定性方面优越的理化特性， 将石墨烯材料应用于酶固定化得到了广泛的关注和研究.

Skoronski 等[6]采用物理吸附和共价键方法将米曲霉漆酶固定在石墨烯上， 两种固定化方法均拓展了漆酶的pH耐受范围， 并提高了酶的最适催化温度. 物理吸附固定化的酶在第二次反应后迅速失去活性， 而共价固定化酶在重复利用6次反应后仍保持约80%的活性. 但是单纯利用石墨烯吸附固定化酶效率较低， 缺乏官能团会展现出较低的固定化酶催化活性[7]， 需要对石墨烯载体进行改性.

Shan等[8]报道了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和离子液体功能化的聚乙烯亚胺(PFIL)修饰石墨烯材料， 作为固定化葡萄糖氧化酶(GOD)的载体， 构建的生物传感器具有更宽的线性检测范围. 将石墨烯与导电高分子结合， 复合材料兼有无机材料和高分子有机材料两者的优点， 将其用于生物传感器可以有效提高传感器的灵敏度和响应电流， 缩短响应时间[9].

Seelajaroen等[7]将甲酸脱氢酶(FDH)交联固定在石墨烯上， 进一步固定化到碳毡上获得GO-FDHs-海藻酸盐碳毡3种不同脱氢酶修饰电极， 可高效地进行电子传递， 并将二氧化碳还原为甲醇， 催化反应20 h基本活性不下降. 对石墨烯进行改性得到的复合材料在作为酶载体领域的应用前景广泛， Ji等[10]对石墨烯/聚合物复合纤维材料的制备、 性能和应用方面进行了综述.

1.2 氧化石墨烯

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)表面丰富的官能团如羧基(-COOH)、 羟基(-OH)和环氧基(-O-)等含氧官能团， 具有可修饰性高和生物相容性好等优点， 增加了氧化石墨烯的化学反应活性， 并扩大了石墨烯平面层之间的间距[11]. 酶可基于共价键固定在氧化石墨烯上， 也通过静电、 氢键和π-π等弱相互作用进行非共价固定化.

Lin等[12]制备了镍离子配位氧化石墨烯复合材料(GO-Ni)， 作为固定化甲酸脱氢酶的新型载体. 与GO-FDH相比， GO-Ni的酶负载量提高了5.2倍. GO-Ni-FDH的热稳定性、 贮存稳定性和重复再利用稳定性均优于GO-FDH. 作者从配位键、 静电力等方面研究了酶与氧化石墨烯的多重相互作用机理. Zhou等[13]通过双亚胺活化的酰胺化反应定向固定化葡萄糖氧化酶(GOD)， 且游离GOD和定向固定化GOD的Km值相近， 说明固定化未影响酶和底物的结合. Samsam等[14]以戊二醛将乳过氧化物酶(LPO)共价固定在功能化氧化石墨烯上. 固定化后酶基本没有失活， 且固定化酶在12次循环使用后， 仍有50%的催化活性， 而游离酶仅余30%的活性. 室温储藏30 d后， 固定化酶保留64%活性， 而游离酶则已失活.

氧化石墨烯固定化酶在生物微反应器中的应用成为研究热点. Li等[15]报道了氧化石墨烯(GO)和L-乳酸脱氢酶(L-LDH)之间利用疏水相互作用， 通过层层组装制备毛细管电泳(CE)集成的固定化酶微反应器(IMERs). 使用5 d后固定化酶的活性仍保持在90%左右. 固定化L-LDH对丙酮酸和NADH的Km值与游离酶基本一致. 该方法成功地应用于啤酒样品中丙酮酸含量的测定， 并为毛细管电泳(CE)集成固定化酶微反应器提供借鉴.

氧化石墨烯-高分子复合材料可以通过高分子对石墨烯表面进行功能化， 克服由于强静电和疏水相互作用可能造成的酶构象变化和失活等问题[16]， 因而广泛地应用于酶固定化领域. Lin等[17]研究了聚乙烯亚胺复合(polyethylenimine， PEI)的氧化石墨烯(GO-PEI)材料用于固定甲酸脱氢酶. 与氧化石墨烯直接吸附的甲酸脱氢酶相比， GO-PEI固定化酶的热稳定性、 储存稳定性和重复使用稳定性均得到增强. Zhu等[18]合成镍离子配位的氧化石墨烯(GO)纳米材料， 固定化细胞色素c氧化酶(CcO). 固定的CcO的转换率高达每秒240个O2分子. 本课题组利用聚乙烯亚胺接枝氧化石墨烯(GO)得到 GO-PEI， 固定化苯丙氨酸脱氢酶. 利用Ni2+， Mn2+， Mg2+等金属离子对 GO-PEI 载体配位后进行酶的固定化， 载体以金属配位、 静电作用和氢键等多种作用力与酶结合. 通过调控 pH值使 PEI 质子化， 可降低吸附层对蛋白的电荷排斥， 提高了酶的负载量[19]. 这是由于利用高分子或者金属对GO进行改性修饰能显著改善GO的间层间距和层间作用力， 使得固定化效果得到提升.

1.3 还原氧化石墨烯

还原氧化石墨烯(CRGO)是由氧化石墨烯进行不同程度还原获得的二维碳材料. 与GO相比， 还原氧化石墨烯表面官能团减少， 疏水性增强， 可减少片层间静电作用引起的堆积现象. CRGO能够较好保持单层和二维结构， 具有比表面积大、 生物相容性好等优点， 有利于酶等生物催化剂的固定.

Zhang等[20]通过疏水相互作用将辣根过氧化物酶(HRP)和草酸氧化酶(OxOx)分别固定在还原氧化石墨烯上， 与氧化石墨烯固定化酶比较， 酶负载量、 稳定性和活性均有提升. Vineh等[21]以戊二醛作交联剂， 将辣根过氧化物酶(HRP)固定在还原氧化石墨烯上，kcat和kcat/Km分别提高了6.5倍和8.5倍. 其可重复使用性也显著提高， 固定化酶在10次催化循环后仍能保持70%以上的活性. Ormategui等[22]报道了高疏水性聚合物与石墨烯材料结合形成水凝胶结构, 将还原氧化石墨烯与甲基丙烯酸甲酯(MMA)/丙烯酸丁酯(BA)共聚物自组装合成复合水凝胶， 共价固定化漆酶， 获得了高效稳定的纳米生物催化体系. 王世珍等[23]利用金属配位的还原氧化石墨烯从破胞液中原位分离固定化苯丙氨酸脱氢酶， 具有较高的酶活性回收率. 研究表明, 还原氧化石墨烯的还原程度和固定化体系的盐浓度对原位固定化酶具有一定影响， 提高盐浓度可提高酶活回收率. Zhou等[24]利用聚多巴胺(PDA)修饰氧化石墨烯表面， 得到PDA/rGO生物复合材料， 固定化葡萄糖氧化酶(GOD). 固定化后的米氏常数(Km)接近游离酶的米氏常数， 且固定化酶的热稳定性、 pH稳定性、 贮存稳定性和对变性剂的抗性均有显著提高.

还原氧化石墨烯比石墨烯和氧化石墨烯具有更好的导电性， 因此在生物传感器和生物电催化中具有良好应用前景. Ye等[25]制备了一种由壳聚糖、 还原氧化石墨烯和金纳米颗粒组成的复合材料. 将纳米复合材料沉积在玻碳电极上后固定化葡萄糖氧化酶(GOx)以获得检测葡萄糖的生物传感器. 该生物传感器灵敏度为13.58 μA· (mmol·L-1·cm2)-1, 检测限为0.52 μmol·L-1， 米氏常数Km为2.39 mmol·L-1， 且检测线性范围宽. Berchmans等[26]使用聚酰胺-胺型树状聚合物与还原氧化石墨烯共价结合. 通过戊二醛共价固定化辣根过氧化物酶实现H2O2检测， 该酶传感器表现出良好的稳定性. Hua等[27]将葡萄糖氧化酶(GOD)固定在电化学还原的氧化石墨烯(ERGO)上， 进一步吸附在聚L-赖氨酸(PLL)修饰的玻碳电极上. GOD/ERGO/PLL/GC电极可实现对葡萄糖的直接电子转移， 具有良好的电催化活性， 其线性范围为0.25～5.00 mmol·L-1. Wu等[28]以聚乙烯亚胺和还原氧化石墨烯(PEI-rGO)的复合材料固定化胆固醇氧化酶(ChOx)， 采用逐层组装的方法制备了电化学检测平台. 测定其表观Km为0.0431 mmol·L-1， 表明固定化后的ChOx与胆固醇有良好的亲合力. 由于PEI-rGO复合材料具有良好的导电性能， 固定化后的ChOx在玻碳电极(GCE)上的电子转移能力大幅度增强.

1.4 碳纳米管(CNTs)

石墨烯通过围绕旋转轴卷曲可形成碳纳米管， 由于其高长径比， 因此通常被认为是一维材料. 碳纳米管具有高比表面积、 良好导电性和高机械强度等优点， 作为一种高效的固定化支撑材料， 被广泛应用于催化、 材料制备等领域.

本课题组以聚多巴胺(PDA)修饰的多壁碳纳米管为载体固定化氧化还原酶. 多巴胺表面富含伯氨基和酚羟基， 可以与金属离子进行配位形成配体聚合物(PDA-M)， 增强MWCNTs亲水性以及载体与酶的相互作用. PDA-M配位固定化苯丙氨酸脱氢酶， 酶活回收率提升2倍. 固定化酶在高温下和有机溶剂体系中稳定性增强， 展现出了良好的抗逆性能. Zhang等[29]通过水热反应将磁性Fe3O4与多壁碳纳米管合成了Fe3O4/MWCNTs复合材料固定化辣根过氧化物酶， 用于去除废水中的酚类物质. 固定化酶的温度稳定性和pH稳定性优于游离酶. Cai等[30]制备CTS修饰的磁性碳纳米管(CTS-Fe3O4/CNTs)固定化辣根过氧化物酶， 提高了酶的耐热性和pH耐受性、 重复利用次数和保存时间. 将酶固定在碳纳米管及其衍生的纳米复合材料， 因其具有效的负载能力和良好的机械性能等， 有助于构建具有广泛工业生物应用前景的纳米生物催化体系.

碳纳米管可深入酶的活性中心， 为酶和电极之间构筑良好的电子转移通道， 同时也推动了以此为基础的酶传感器和生物电催化的研究. Bahar等[31]利用多壁碳纳米管(MWCNTs)、 聚乙烯亚胺(PEI)和碳布固定化葡萄糖氧化酶， 获得带活性醛基团的固定化酶电极. 通过共价交联， 固定化酶作为生物阳极的半衰期从27.2 h提高到124.7 h， 提高了4倍以上. 与非交联固定化酶在电极上的动力学参数相比， 交联酶电极的表观Km仅增加了16%， 而最大反应速率vmax仅降低了3%. Hyun等[32]提出通过加入阳离子表面活性剂和稳定剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对葡萄糖氧化酶基于物理吸附固定化， 明显改善碳纳米管葡萄糖传感器的灵敏度和稳定性. Wee等[33]利用CNTs固定化酪氨酸酶(TYR)制备电极， 开发出高灵敏度的酚类生物传感器. 分别制备TYR通过吸附(EA)、 沉淀(EAC)和交联(EAPC)获得的固定化样品. EAPC与酶吸附和酶吸附/交联相比， TYR活性分别提高10.5和5.4倍. 这种高敏感酶生物传感器在现场检测环境污染物方面具有巨大的应用潜力. Mao课题组[34]利用乙醇、 乙腈和丙酮等有机溶剂的表面浸润效应调控酶和电极之间的相互作用， 优化碳纳米管表面酶分子的取向， 促进酶分子的直接电子转移， 可有效提高生物电化学催化的性能. 在制备漆酶-碳纳米管复合物的过程中， 加入20%乙醇溶液明显提高电极对于氧气电化学催化的电流. 乙醇分子吸附于碳纳米管表面提高其浸润性. 碳纳米管曲面与漆酶凹槽的对接， 通过优化蛋白在碳纳米管上的取向促进了铜离子活性中心与电极间的高效直接电子传递.

碳材料通常可用共价法和非共价法进行修饰， 共价技术可以获得具有强相互作用的碳基复合材料. 共价固定化碳纳米管-酶配合物具有独特的理化性能， 如高催化性能、 稳定性、 低传质阻力和高效回收率. 非共价固定化方法能够保持碳材料的结构等固有的特性， 同时改善材料的可分散性和稳定性. 与共价法相比， 非共价法能够更好地保持酶的天然构象[10]. 非共价相互作用包括π-π键作用、 氢键作用、 静电作用、 配位键和范德华力， 这些相互作用力影响着碳材料与酶之间的相互作用. 在酶吸附碳材料的过程中， 芳香族氨基酸与碳材料形成的π-π作用是主要的推动力[35]. 对碳材料表面的修饰会显而易见地影响酶与固定化载体的相互作用， 而酶与固定化载体界面的相互作用力仍然有待深入研究， 选择合适的酶固定化方法仍需要考虑酶本身的性质、 碳材料的特点以及经济性等因素.

碳材料的性质各有千秋， 因此在固定化酶领域用途不同. 碳材料固定化氧化还原酶的优缺点如表1所示[25, 36-37].

表1 固定化酶常用碳材料的优缺点

2 金属-有机框架固定化酶

金属-有机框架是发展迅速的高结晶性多孔材料. 由于MOF材料结构可调， 可用于设计、 构建刚柔并济的生物-化学复合纳米催化剂. 有机配体类型众多， 结合不同种类金属离子基于配位数， 可以形成不同孔径的骨架结构. 因此， MOF在酶的固定化方面具有广阔的应用前景.

Stoddart等[38]报道了利用NU-100x(x=3, 4, 5, 6, 7)系列锆基MOF， 通过调控其多级介孔结构的孔道尺寸实现乳酸脱氢酶(LDH)的固定化负载. 固定在NU-100x大孔中的酶可高效催化底物并实现辅酶NADH的原位再生. 温莉茵[39]所制备的金属有机框架材料纳米多酶催化体系可用于CO2的还原， 反应时间为2 h, 甲酸产量高达23.86 μmol， 多酶偶联体系的活性远高于游离酶.

原位合成法是指将酶溶液与MOFs的前体(如金属盐和配体) 混合在一起， 在MOFs结构的形成、 生长过程中实现酶包埋的固定化策略. Xia等[40]将醇脱氢酶(ADH)封装到金属有机骨架HKUST-1晶体中， 构建了化学-酶法催化体系. HKUST-1可以实现辅酶β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的原位再生. 固定化酶与游离酶相比， 能耐受尿素和有机溶剂， 并且在6个循环后仍保持93%的活性. ADH@HKUST-1复合材料的产物收率达28.5%， 比游离酶高4.3倍. 该课题组还将葡萄糖氧化酶(GOx)和具有过氧化物酶活性的金属有机骨架MOF-545(Fe)组合起来， 构建了化学-酶法耦联催化体系[41]. GOx@MOF-545(Fe)可快速检测葡萄糖， 具有低检测限(0.28 μmol·L-1)和高特异性等优势， 并表现出优异的可重复使用性和稳定性. 在室温下保存7 d后仍保留了92%的活性， 而游离酶仅保留了40%的活性. 重复利用5个循环后， 固定化酶还能保持71%的活性.

基于锆(Zr)的MOF材料(NU-10xx系列)在各种酸性和碱性环境中均有出色的稳定性， 常用作酶的固定化载体. Zhang等[42]使用Zr4+和2-甲基咪唑(2MIm)形成的配位聚合物(CPs), 在水性环境中通过简单的两步法, 合成了共固定化的多酶纳米反应器. 使用6-磷酸葡萄糖脱氢酶和α,β-不饱和酮还原酶形成的多酶耦联体系(G6PD@Zr-2MIm / KRED)可用作NADPH辅酶再生的酶反应器. 此多酶体系表现出良好的重复性和存储稳定性， 在高温和不同pH值下均具有良好的耐受性. 且该反应器反应15 min可获得95%以上的转化率. 保存4 d后活性保留70%， 进行4次重复利用后， 活性保留80%. Chen等[43]将甲酸脱氢酶(FDH)固定在NU-1006中， 通过在玻碳电极上共沉积电子中介体和酶@MOF， 高效电催化CO2生成甲酸的体系. FDH@NU-1006转化NADH的效率比游离FDH高约3倍， 并可实现辅酶NADH的再生.

Torkzadeh等[44]合成了Fe3O4NPs@Ni-MOF材料， 用于固定D-乳酸脱氢酶(D-LDH). 利用分子动力学模拟， 研究了Fe3O4NPs@Ni-MOF对D-LDH的吸附和构象的影响. MOF中的Ni离子与酶的氨基酸残基形成π-π相互作用. Fe3O4NPs@Ni-MOF有效保护了酶的构象， 减少二级结构的变化， 从而提高了酶的热稳定性.

蛋白质与疏水表面的相互作用常常引起酶的构象变化， 导致变性以及失活. Liang等[45]比较了不同亲疏水性的3种MOF固定化酶的效果. 选取亲水性的MAF-7、 ZIF-90和疏水性的ZIF-8， 分别固定化过氧化氢酶和脲酶. 当这两种酶封装于亲水性的MOF中时， 在高温和有机溶剂等环境中酶稳定性较好. 而采用疏水性的MOF固定化酶， 在同样的反应条件下基本无活性. 此结果表明， 优化酶和封装材料之间的疏水/亲水相互作用， 对于高效封装和提高生物分子稳定性至关重要. MOF材料固定化氧化还原酶的代表性例子如表2所示.

表2 MOF材料固定化氧化还原酶

共价有机框架(covalent organic frameworks, COFs)是通过可逆共价键连接的多孔有机材料. 因具有高比表面积、 低密度、 规则的孔隙和易于功能化表面等优点， COFs固定化酶领域具有应用潜力[46]. 通过改变COF上的官能团可调控COF与酶之间的特定相互作用， 而COF连续的孔道为固定化酶提供了良好的微环境[47]. Li等[48]提出一种固定化酶新策略， 先用MOFs对酶进行固定后， 通过除去MOF中的金属离子， 将酶释放到所合成的COF胶囊中. COF胶囊较大的空间尺寸提供给酶较大的自由度， 有利于其构象的保持并提供催化和传质所需的空间， 从而大大提高固定化酶的活性. 该固定化策略可为多酶固定化以及多酶级联反应提供新的平台.

优化MOF和COF内部酶的构象和空间分布、 反应物及底物接触、 辅因子和底物的扩散等是MOF材料设计的关键. 且要实现高效的多酶催化和辅酶电再生的生物串联反应仍是挑战. 然而， 具有导电性能的MOF和COF固定化酶还鲜见报道.

3 总结与展望

目前, 新型材料固定化氧化还原酶研究主要基于调控酶与载体相互作用力进行微观表界面设计， 构建生物相容性的微环境. 采用的新策略主要包括导电高分子修饰、 碳材料界面可控修饰、 离子液体等小分子修饰、 改性等. 本研究主要考察新型载体的化学组成、 表界面性质等对酶分子结构、 稳定性、 催化本征和表观动力学、 底物和产物传递过程的影响机制.

目前该领域主要存在的难点包括： 载体多尺度组装与可控修饰、 酶与材料界面相互作用力的精确调控， 基于多层次作用力组装构建仿生界面等. 针对这些问题， 提出以下解决方案.

1) 固定化酶材料元件的精准构筑. 发展基于微纳制造的方法， 将生物大分子的固定于微电极和阵列电极. 通过3D打印、 静电纺丝等在内的催化剂界面构筑方法， 设计和调控载体孔径， 实现酶和载体孔道之间的尺寸匹配[49].

2) 仿生固定提高生物催化剂的稳定性. 通过模拟自然界酶天然固定化的环境， 基于多层次相互作用力的仿生组装. 研究固定化酶和多酶体系催化反应体系的协同和强化方法， 探索区域化效应等对酶分子内和界面的底物, 电子传递以及酶催化效率的影响机制； 原位固定化酶以减少分离纯化过程的酶活损失， 降低时间和经济成本[50].

3) 固定化酶的大规模制备技术与工程放大. 针对具有工业应用背景的酶固定化体系， 探索适合规模化应用的新型通用性酶特异固定化技术、 工程放大技术和反应器设计. 开发适合规模化制备的、 结构表面组成孔径尺寸可控的新型通用性酶固定化载体材料[51].

4) 复合生物相容性导电材料. 设计新型环境响应的材料， 提供新的固定化机制并促进电极与生物催化剂之间的电子传递效率， 提高生物催化剂的电催化活性. 通过离子液体等导电分子修饰固定化材料， 优化酶与电极界面电子传递， 有利于酶催化性能的增强， 将其用于生物传感器可以有效提高传感器的灵敏度和响应电流. 新型材料固定化氧化还原酶在开发纳米结构或介导再生的修饰电极以及开发微反应器中降低过电位和减少副反应实现更高效率的辅酶电再生有很大的空间[52].