细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A基因表达与胰腺癌临床病理特征的关系

盖守娟

(朝阳市第二医院消化内科，辽宁 朝阳 122000)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是消化道常见恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后较差，在癌症相关的死亡中居第3位[1]。近年来，PC发病率呈现上升趋势，PC早期症状不典型，许多患者确诊时已处于局部进展或远端转移阶段，错过了最佳手术时机，导致5 a生存率低于9%[2]。因此，早期诊断、及早治疗是改善PC患者预后的关键。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)基因是PC中最常见的体细胞突变基因之一，其突变可能会增加罹患PC的风险，且CDKN2A基因启动子区过度甲基化在PC的发生、发展中起着至关重要的作用[3-4]。CDKN2A基因的缺失可通过负反馈导致细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)、细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)活性增加，从而促进细胞周期进程[5-6]。本研究通过观察CDKN2A基因表达与胰腺癌临床病理特征的关系，探讨CDKN2A在PC发生、发展中可能发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 组织标本来源选择2016年1月至2018年6月朝阳市第二医院保存的88例PC患者的PC组织标本，其中男52例，女36例；年龄43～73(60.20±9.28)岁，体质量指数18.9～26.3(22.78±3.01) kg·m-2。病例纳入标准：(1)经病理学检查确诊为PC；(2)术前未行放射治疗、化学治疗等抗肿瘤治疗；(3)临床病理资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)有免疫系统疾病、血液系统疾病、全身感染性疾病、肝肾功能障碍等其他基础疾病；(3)失访者。同时选择相应正常胰腺组织标本30例作为对照，其中男20例，女10例；年龄45～69(58.22±8.78)岁，体质量指数20.5～26.7(23.04±2.96)kg·m-2。2组患者的性别、年龄、体质量指数比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 反转录定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测PC组织和正常胰腺组织中CDKN2A mRNA的表达PC组织和正常胰腺组织各取100 mg分别置入EP管内，加入TRIzol进行组织溶解，然后加入0.3 mL氯仿，室温下震荡30 s，放置30 min，取上清液移入另一EP管，加入等体积的异丙嗪溶液，室温放置30 min，1 000 r·min-1离心10 min，取沉淀物为RNA，加入体积分数75%乙醇1 mL，溶解后1 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入20 μL无核酸酶水。采用SuperScript IV反转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行cDNA合成，引物合成和设计由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，以β-actin为内参；CDKN2A mRNA上游引物序列为5′-CTTTGAGGTGCGTGTTT-3′，下游引物序列为5′-CAGTGCTCGCTTAGTGC-3′；β-actin上游引物序列为5′-GGATCCTGCGATGTGCA-3′，下游引物序列为5′-GGTCAAAGTCCAGGCT-3′。将RNA模板、引物、dNTP、DTT、RT缓冲液混合，组成20 μL体积的反转录体系，根据说明行PCR检测。采取2-ΔΔCt法计算CDKN2A mRNA的相对表达量。实验设3组复孔，取均值。

2 结果

2.1 PC组织和正常胰腺组织中CDKN2A mRNA相对表达量比较PC组织和正常胰腺组织中CDKN2A mRNA相对表达量分别为1.43±0.56、2.03±0.87，PC组织中CDKN2A mRNA相对表达量显著低于正常胰腺组织，差异有统计学意义(t=3.531，P<0.05)。

2.2 CDKN2A基因表达与PC临床病理特征的关系结果见表1。以正常胰腺组织中CDKN2A mRNA相对表达量均值2.03为界值，PC组织中CDKN2A基因高表达者36例，低表达者52例。CDKN2A基因高表达与低表达患者的性别、年龄、肿瘤部位比较差异无统计学意义(P>0.05)；CDKN2A基因高表达与低表达患者的肿瘤直径、组织分化程度和肿瘤临床分期比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 CDKN2A基因表达与PC患者临床病理特征的关系

2.3 CDKN2A mRNA表达与PC患者生存率的关系结果见图1和图2。CDKN2A mRNA高表达和低表达患者2 a总生存率分别为66.67%(24/36)、34.62%(18/52)，CDKN2A mRNA低表达患者2 a总生存率显著低于高表达患者，差异有统计学意义(χ2=8.516，P<0.05)；CDKN2A mRNA高表达和低表达患者2 a疾病无进展生存率分别为58.33%(21/36)、23.08%(12/52)，CDKN2A mRNA低表达患者2 a疾病无进展生存率显著低于高表达患者，差异有统计学意义(χ2=10.370，P<0.05)。

图1 CDKN2A基因表达与PC患者2 a总生存率的关系

图2 CDKN2A基因表达与PC患者2 a疾病无进展生存率的关系

3 讨论

PC的发病机制尚不完全明确，其发生与遗传因素、饮食因素或者基础性胆道系统疾病等有关[7]。有研究显示，长期高蛋白、高脂肪饮食的PC患者的预后更差，其带瘤生存率降低，中位生存时间明显缩短[8-9]。基因水平改变及癌细胞周期调控基因异常可能在PC发生、发展中发挥作用。CDKN2A基因定位于9号染色体21区，编码1个由148个氨基酸组成的蛋白[10]。有研究显示，CDKN2A基因编码的蛋白可与CDK4、CDK6结合而抑制细胞周期蛋白与CDK4结合形成具有激酶活性的复合物，阻断该复合物对成视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化，将细胞阻滞于G1期，从而抑制细胞增殖[11]。研究显示，CDKN2A基因是一种肿瘤抑制基因，其纯合性缺失与杂合性缺失是黑色素瘤发生的重要机制之一[12]。CDKN2A基因编码细胞周期抑制剂蛋白p16和p14，在90%～98%的胰腺导管腺癌细胞中由于基因突变或启动子过度甲基化导致CDKN2A基因丢失[13-14]。本研究结果显示，PC组织中CDKN2A mRNA相对表达量显著低于正常胰腺组织，且肿瘤直径越大、组织分化程度越低、肿瘤临床分期越高的患者CDKN2A基因表达越低，提示CDKN2A基因低表达可能与PC的发生与发展有关，CDKN2A基因可抑制胰腺导管上皮细胞增殖，减弱肿瘤细胞的浸润能力，但其具体机制仍不明确。

PC发病隐匿，早期症状不典型，多数患者确诊时已属于晚期，预后差，生存期短，5 a生存率低[15]。本研究结果显示，CDKN2A基因高表达和低表达患者2 a总生存率分别为66.67%(24/36)、34.62%(18/52)，2 a疾病无进展生存率分别为58.33%(21/36)、23.08%(12/52)，CDKN2A基因低表达患者2 a总生存率和2 a疾病无进展生存率显著低于高表达患者，提示CDKN2A基因表达与PC患者的预后有关。

综上所述，PC组织中CDKN2A基因表达下调，且CDKN2A基因表达与肿瘤大小、组织分化程度、肿瘤临床分期及患者生存状况有一定关系，CDKN2A基因检测可为PC患者的病情及预后评估提供参考。