疏肝温胆汤对动脉内皮损伤模型兔LXR、TNF-α的影响∗

赵 帅 庄杰钦 蔡海荣 郭永宁 张为章 陈伯钧

（广州中医药大学第二临床医学院，广东省中医急症研究重点实验室，广东 广州 510006）

动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的主要病理过程，现已成为全球死亡的主要原因［1］，而血管内皮损伤又是动脉粥样硬化发病的始动环节［2］。长期慢性危险因素暴露损伤血管内皮系统，引起内皮功能障碍，出现氧化应激、炎症反应失衡等病理状态。其中炎症反应是动脉粥样硬化内皮损伤的主要机制。近年来，中医药防治动脉粥样硬化及内皮功能损伤障碍的深入研究不断增多，许多研究发现像丹参、黄芪等中药可以保护内皮细胞从而防治动脉粥样硬化［3］。疏肝温胆汤由柴胡疏肝散与温胆汤裁化而成，是本文通信作者、广东省中医院名中医陈伯钧教授治疗心脑血管疾病的临床经验方。本团队前期研究发现疏肝温胆汤具有调控肝X受体a（LXRa）表达，抑制动脉粥样硬化进展的作用［4］。有研究表明，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症通路的主要下游因子，LXR有调控炎症反应的重要作用，LXRa能影响TNF-α因子表达［5］。因此，本项目以LXRa为切入点，以炎症通路为干预靶点，观察疏肝温胆汤对动脉内皮损伤的影响及可能机制，进一步探讨疏肝温胆汤保护动脉内皮的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只清洁级3月龄的新西兰雄兔，广州市花都区花东信华实验动物养殖场［许可证号：SYXK（粤）2019-0023］，体质量2.0～3.0 kg，在广东省中医院动物实验中心饲养。适应性喂养10 d，饲养条件：室温（22±4）℃，相对湿度（58±6）%，光照与黑暗循环时间为12 h，饮用水经过121℃高温灭菌30 min，自由摄取。本研究通过广东省中医院动物伦理委员会审查，伦理号：2019057。

1.2 实验药物

疏肝温胆汤，组成：法半夏10 g，竹茹12 g，枳实12 g，陈皮 15 g，炙甘草6 g，茯苓20 g，柴胡12 g，白芍15 g，丹参15 g。均为配方颗粒制剂，购自广东一方制药有限公司。使用时按比例用水均匀混合调配。

1.3 试剂及仪器

牛血清蛋白（广州威佳生物有限公司，批号：20160725）；戊巴比妥钠（美国Sigma公司，批号：209H1343）；一氧化氮（NO）测试盒（硝酸还原酶法）试剂盒（96T）（南京建成生物工程研究所，货号：A013-2-1）；内皮素-1（ET-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海古朵生物科技有限公司，批号：20170412）；苏木素染液及伊红染液（谷歌生物，批号：Y1424）；新型mRNA抽提试剂 Trizol（MRC，货号：TR118-500）；反转录酶试剂MMLV Reverse Transcriptase（Promega，货号：M1705）；PCR 试剂 GoTaq® qPCR Master Mix（Promega，货号：A6002）；紫外透射分析仪（Hema，UV-3A）；电泳仪（Tanon，EPS300）；紫外可见分光光度计（上海奥谱勒仪器，UV-752P）；显微镜（型号：NIKON Eclipse ci）；成像系统（NIKON digital sight DS-FI2，MADE IN JAPAN）；基因扩增仪（Hema，货号：Hema9600）；Real-time Quan⁃titative PCR（Bio-Rad，货号：Bio-Rad CFX96）等。

1.4 分组与造模

将30只新西兰雄兔随机分为3组，即空白对照组、模型对照组、疏肝温胆汤组，每组各10只。空白对照组予耳缘大静脉一次性注射250 mg/kg的0.9%氯化钠注射液，模型对照组及疏肝温胆汤组雄耳缘静脉一次性注射250 mg/kg牛血清白蛋白。空白对照组予基本饲料喂养，模型对照组及疏肝温胆汤组喂饲高脂饲料（2%胆固醇、4%猪油、10%蛋黄粉及84%基础饲料），各组动物每日进食总量相等，限制为100 g，分2次，每12小时给食1次。所有动物分笼饲养。各组动物分别于4周末行血管超声检测，动脉内膜有粥样斑块形成为造模成功标准，未达标者予以剔除。

1.5 给药方法

造模成功后，空白对照组雄兔饲养于SPF级动物房，喂普通饲料，自由进食。模型对照组雄兔饲养于普通动物房，采用高脂饲料喂养，不限制进食，按5 mL/kg体质量灌胃0.9%氯化钠注射液，每日1次。疏肝温胆汤组雄兔饲养于普通动物房，采用高脂饲料喂养，不限制进食，按5 mL/kg体质量灌胃疏肝温胆汤，每日1次。各组给药干预时间均为4周。

1.6 标本采集与检测

在为期4周的药物干预后，对每组所有雄兔进行取样。在雄兔耳缘大静脉进行采血后注入含有2 g/L EDTA-2Na 30 μL和抑肽酶40 μL试管中混匀，40 ℃3 000 r/min离心30 min，分离血浆，立即冻存于-45℃低温冰箱中备测。所有操作均由本院中心实验室专人严格按操作规程进行。采血样结束后再予戊巴比妥麻醉过量处死，解剖取出主动脉节段，用0.9%氯化钠注射液反复冲洗，再用10%甲醛中固定后放入-80℃冰箱中保存待送检。

1.6.1 硝酸还原酶法测定NO 将前期取得的样本置室温下复融后，再次3 000 r/min离心5 min，取上清液，现配置显色剂及标准应用液，设置空白孔、测定孔和标准孔，每个组做3个复孔，于分光光度计550 nm处用酶标仪测各管的吸光度OD值。NO含量（μmol/L）=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（20 μmol/L）×稀释倍数（4倍）

1.6.2 ELISA检测ET-1 同理将样本复融后再次离心取上清液，设置好标准品孔和样品孔，取50 μL不同浓度的标准品加入标准品孔中，样品孔中先加入样本稀释液40 μL，随后再加入10 μL血清样品，空白孔不加任何东西，标准品孔和样品孔中每孔加入二抗100 μL，用封板膜封住反应孔，于37℃恒温箱中温育60 min；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；每孔中加入底物A、B各50 μL，于37℃恒温箱中避光孵育15 min；每孔中加入终止液50 μL，15 min内于酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度OD值。根据标准品浓度及OD值做标准曲线，并根据标准曲线得出的公式计算各样品的ET-1含量。

1.6.3 HE染色法检测各组主动脉的病理变化 将新鲜组织标本固定于4%甲醛中24 h以上，选择组织标本的最大切面进行修整后放置于脱水仪依次梯度酒精脱水及浸蜡3 h，包埋、切片，38℃的温箱内过夜，取出室温保存，进行脱蜡水化，苏木素-伊红染液染色，染色后脱水中性树胶封片，显微镜下镜检并拍照。

1.6.4 荧光定量PCR检测CRP、LXRa、TNF-α的mRNA表达水平 在NCBI上搜索到目的基因，再用primer5.0设计引物，引物有CRP-Rabbit-QPCR-F、CRP-Rabbit-QPCR-R、LXRa-Rabbit-QPCR-F、LXRa-Rabbit-QP⁃CR-R、TNF-Rabbit-QPCR-F、TNF-Rabbit-QPCR-R、β-actin-Rabbit-QPCR-F、β-actin-Rabbit-QPCR-R）。提取组织样品中的总RNA，检测总RNA的纯度、浓度及完整性）；cDNA 逆转录；95℃ 120 s（热变性），95℃15 s（变性），60℃ 30 s（退火延伸），760-95℃（溶解曲线），总40个循环；再进行目的基因的扩增。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算靶基因的mRNA相对表达水平，所有靶基因的表达在正常组都设为1。每个样品均重复3次。GraphPad Prism软件计算定量结果和数据。

1.7 统计学处理

应用SPSS23.0统计软件。计量资料均先进行正态分布检验，服从正态分布以（±s）表示，不服从正态分布则用中位数+四分位间距表示。服从正态分布的两组数据采用独立样本t检验，多组数据则采用单因方差分析检验。不服从正态分布的计量资料使用Krus⁃kal-Wallis秩和检验。具有统计学差异的组间进行两两比较，采用Bonferroni法校正P值。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组兔动脉内膜损伤的病理变化

空白对照组主动脉标本内膜多光滑平整，内皮细胞呈扁平状，平滑肌细胞呈长梭形状且排列整齐，细胞核大小均匀，细胞膜及核膜清晰完整，浆内染色均匀，胞内未见泡沫状改变，管壁无脂质沉积，管腔未见明显狭窄；模型对照组主动脉大部分内膜明显增厚，并能够看见大量的胞内泡沫细胞聚集，泡沫细胞体积较大，呈圆形或椭圆形，胞质内含有大量空泡，从而导致管腔明显变狭窄；疏肝温胆汤组主动脉内膜局部可见轻度增厚，并能够看见少许泡沫样改变，部分管腔有少许狭窄，但其病变程度轻于模型对照组。见图1。

图1 各组兔动脉内膜损伤病理变化（HE染色，200倍）

2.2 各组兔动脉内膜内皮功能指标比较

见表1。与空白对照组比较，模型对照组中的血浆NO水平明显降低（P<0.05），ET-1水平明显升高（P<0.05）；与模型对照组比较，疏肝温胆汤组血浆NO水平明显升高（P<0.05），ET-1水平明显降低（P<0.05）。

表1 各组兔动脉内皮功能指标比较（±s）

表1 各组兔动脉内皮功能指标比较（±s）

组别空白对照组模型对照组疏肝温胆汤组n 10 10 10 NO（μmol/L）65.15±42.28 1.90±0.48 3.95±0.64 ET-1（ng/L）43.00±6.17 59.43±5.50 37.00±3.47

2.3 各组兔CRP、LXRa、TNF-α的mRNA表达水平比较

见表2。与空白对照组比较，模型对照组中LXRa的mRNA表达水平明显减少（P<0.05），CRP、TNF-α、NOX-2的mRNA表达水平明显增多（P<0.05）；与模型对照组比较，疏肝温胆汤组血浆LXRa的mRNA表达水平明显增多（P<0.05），CRP、TNF-α的mRNA表达水平明显减少（P<0.05）。

表2 各组兔CRP、LXRa、TNF-α mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组兔CRP、LXRa、TNF-α mRNA表达水平比较（±s）

组别空白对照组模型对照组疏肝温胆汤组n 10 10 10 CRP 0.98±0.03 2.31±1.16 0.91±0.10 LXRa 1.03±0.06 0.64±0.28 0.98±0.10 TNF-α 0.97±0.09 1.51±0.17 1.06±0.05

3 讨 论

肝脏是机体转运调节代谢胆固醇的重要反应器官，肝X受体（LXRs）是其重要核受体之一，与机体内多种生理活动息息相关，有LXRα和LXRβ两种亚型，其中LXRα与胆固醇代谢、调节炎症过程、调节相关基因的转录更是被广泛研究［6］。由此，肝X受体调节代谢和炎症的作用及途径成为防治疾病的突出靶点及研究热点。既往已有研究证实LXR具有抗炎的作用，其可调控炎症因子的表达，参与机体炎症反应的调节［7-8］。LXR亦表达于巨噬细胞，而巨噬细胞在炎症和免疫反应中起至关重要的调节作用［9］。更有研究发现LXRs激动剂可以抑制一系列炎症因子的表达，像TNF-α、IL-6、CRP等在核酸和蛋白质水平上的表达［10］。NO与ET-1是由内皮细胞分泌的两种重要的血管舒缩因子，具有维持正常血管舒缩和拮抗作用，使血管平滑肌发挥正常功能保持血液循环通畅，在动脉内皮损伤时即可发生功能内皮障碍表现［11］。

动脉内皮损伤是动脉粥样硬化的首发环节，而中医学认为动脉粥样硬化属“痰浊”范畴，气滞为其始动因素，痰浊、瘀血是重要病理产物，也是疾病的中心环节。气机不畅，血瘀湿阻，痰浊内生，痰瘀胶结，痹阻血脉，致病缠绵为其总病机。疏肝温胆汤是陈伯钧教授多年来治疗AS的有效经验方，全方由柴胡疏肝散合温胆汤化裁而成，方中半夏辛温，燥湿化痰，竹茹甘微寒，清热化痰，一温一凉，化痰和胃；陈皮辛苦温，理气行滞，枳实辛苦微寒，降气导滞消痰，亦为一温一凉，理气化痰之力增强；佐以茯苓，健脾渗湿，杜绝生痰之源；加以柴胡疏肝理气，条达少阳气机；丹参配白芍，丹参活血祛瘀，白芍柔肝活血养血；全方组合而成具有化痰祛瘀、疏肝理气之功效。多年来研究结果也显示温胆汤在治疗动脉粥样硬化性病变、调节胆固醇代谢、抑制巨噬细胞泡沫化等方面有一定作用［12-13］。而丹参因其有效成分脂溶性丹参酮类在抗动脉粥样硬化方面的有效性研究更是十分广泛［14］。

本课题组经过多年临床实践及工作总结发现，疏肝温胆汤确实能改善动脉粥样硬化患者症状及长期预后，既往也有研究发现疏肝温胆汤能调节动物模型的血脂水平，缩小动脉粥样硬化斑块面积、减轻动脉硬化程度，且已有研究证实柴胡疏肝散能上调LXRα mRNA的表达水平［15］。而本研究发现：疏肝温胆汤可能通过调控LXR/TNF-α信号通路，抑制炎症反应，进而改善了动脉内皮损伤。因此，本项研究为疏肝温胆汤在临床干预动脉粥样硬化患者提供了循证依据。