花生壳中提取木犀草素及其含量测定

王智儀，郭佳佳，曹智威，冯亚莉

（郑州工业应用技术学院 药学与化学工程学院，河南郑州 451100）

木犀草素（3',4',5,7-四羟基黄酮）是一种天然的抗氧化剂，具有多种生物活性，如抗癌、抗菌、抗炎、心血管保护、改善和治疗阿尔茨海默症等[1-3]，具有广泛的医药价值和应用前景。花生壳是木犀草素的理想来源之一，我国是花生生产、消费和出口贸易最大的国家，花生加工业每年产出大量的花生壳，仅有少量用作饲料或化工原料，既严重污染环境，又造成浪费。因此，开发利用花生壳中的天然黄酮类化合物木犀草素，对于有效延长花生产业链、提高花生资源综合利用效益具有重要的社会意义。如图1 所示，为木犀草素的化学结构。

图1 木犀草素的化学结构

传统的水浴回流法、有机溶剂提取法及碱水提取法等存在得率较低的问题，微波辅助法和超声波辅助法能耗和成本较高，酶辅助提取法及离子液提取技术操作繁琐，不适于工业生产。本文采用连续萃取法提取花生壳中的木犀草素，考察不同萃取剂、萃取剂用量、萃取温度及萃取时间等因素对木犀草素提取率的影响，采用高效液相法对最佳提取条件下的花生壳中木犀草素的提取率及产品纯度进行测定。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

花生壳购于河南省郑州市，粉碎备用；木犀草素标准品（98%），上海麦克林生化科技有限公司；甲醇，色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司；其他所用试剂均为分析纯。

萃取器，郑州市高等学校生药学名师技术技能工作室自制；Agilent-1260 型高效液相色谱仪：美国Agilent 公司。

1.2 实验方法

称取50 g 花生壳干粉于500 mL 烧杯中，加入200 mL 石油醚，搅拌密封后过夜，进行脱脂处理。过滤，花生壳自然挥干后置于萃取器中，加入1 000 mL 75%乙醇，加热回流，控制温度为80 ℃，连续提取2 h。萃取完成后，浓缩提取液至浸膏状，加入10 倍体积蒸馏水，静置后取沉淀置于50 ℃恒温干燥箱烘干，丙酮、乙酸乙酯重结晶，干燥，得木犀草素粗品。

1.3 萃取剂种类的选择

萃取温度为80 ℃，萃取时间为2.0 h，考察不同萃取剂对花生壳中木犀草素含量的影响。由于木犀草素分子结构中有多个酚羟基，属于弱酸性黄酮类化合物，为弱极性分子，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂以及稀碱溶液，因此选用75%乙醇溶液、75%甲醇溶液、75%丙酮溶液、乙酸乙酯、0.2 mol/L NaOH 溶液作为萃取剂。

1.4 萃取剂用量的选择

固定萃取温度为80 ℃，萃取时间为2.0 h，萃取剂为75%乙醇溶液，考察萃取剂用量对花生壳中木犀草素提取率的影响，按料液比（g/mL）为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 进行实验。

1.5 萃取温度的选择

固定料液比（g/mL）为1 ∶20，萃取时间为2.0 h，萃取剂为75%乙醇溶液，考察萃取温度对花生壳中木犀草素提取率的影响，萃取温度分别是40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃。

1.6 萃取时间的选择

固定料液比（g/mL）为1 ∶20，萃取温度为80 ℃，萃取剂为75%乙醇溶液，考察萃取时间对花生壳提取物中木犀草素提取率的影响，萃取时间分别是0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h。

1.7 HPLC 法测含量

1.7.1 溶液配制

标准品溶液：取木犀草素标准品1.00 mg，适量甲醇溶解，转移至1 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声混匀，得浓度为1 mg/mL 木犀草素标准品溶液[4]。

供试品溶液：取木犀草素粗品1.00 mg，适量甲醇溶解，转移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声混匀，得1 mg/mL 的供试品溶液[4]。

1.7.2 色谱条件选择

色谱柱：ZORBAXSB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸溶液（体积比70 ∶30），流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长(λ)：348 nm。

1.7.3 线性关系考察

取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 木犀草素标准品溶液于50 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按“1.3.2”色谱条件依次进样分析，平行测定5 次，取平均值。以木犀草素标准品浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，建立回归方程，进行线性关系考察。

1.7.4 木犀草素含量测定方法

对木犀草素供试品溶液进样测定，测定结果代入标准曲线计算木犀草素浓度，并按照公式（1）～（2）计算木犀草素供试品纯度ω和木犀草素提取率W。

式（1）中，V为供试品溶液的体积，mL；m1为称取的木犀草素供试品质量，mg。式（2）中，m2为提取的木犀草素产品总质量，mg；m为实验称取的花生壳质量，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

标准曲线回归方程Y=29 538X+380.98，R2=0.9974。结果表明，木犀草素在浓度为0.0625～1.000 mg/mL 范围内线性关系良好。标准曲线如图2 所示：

图2 木犀草标准曲线

2.2 不同萃取剂对木犀草素提取率的影响

如表1 所示，75%乙醇溶液作为萃取剂提取的木犀草素提取率最高，75%丙酮溶液次之，因此选择75%乙醇溶液作为萃取剂。

表1 不同萃取剂花生壳提取物中木犀草素的含量

2.3 萃取剂用量对木犀草素提取率的影响

如图3所示，木犀草素提取率随料液比的降低（萃取剂用量增大）而提高，在1 ∶5～1 ∶20 时，木犀草素的提取率增加较快，而当料液比大于1 ∶20 并进一步提高时，木犀草素提取率的增加趋势逐渐变缓。因此，当萃取剂是花生壳质量的20 倍时，即料液比（g/mL）为1 ∶20 时，萃取效果较好。

2.4 萃取温度对木犀草素提取率的影响

图3 料液比对木犀草素提取率的影响

如图4 所示，萃取温度对木犀草素提取率的影响较大：当萃取温度低于80 ℃时，木犀草素提取率随温度的升高而增大，而当萃取温度高于80 ℃时，木犀草素提取率随温度的升高反而有所降低。这是由于在溶剂乙醇溶液提取溶质木犀草素的过程中，温度既影响溶质在溶剂中的溶解速度，又影响溶质向外扩散的速度。另外，温度的升高也会提高木犀草素在萃取剂中的溶解度。但是由于木犀草素为黄酮类化合物，对热比较敏感，高温会加速其氧化，所以萃取温度并非越高越好。根据实验结果可知，当萃取温度为80 ℃左右时，萃取效果较好。

图4 萃取温度对木犀草素提取率的影响

2.5 萃取时间对木犀草素提取率的影响

如图5 所示，随着萃取时间的增加，木犀草素的提取率也增加，但是当时间超过2.0 h 时，木犀草素的提取率呈降低趋势。这是由于长时间的加热会造成木犀草素受热氧化，从而使得木犀草素提取率降低，因此，选择萃取时间为2.0 h 效果较好。

2.6 木犀草素含量测定

由1.7.4 式（1）和式（2）计算可得，花生壳中木犀草素提取率为0.32 mg/g，纯度为67.86%。

3 结论

以75%乙醇溶液为萃取剂，采用连续萃取法从花生壳中提取木犀草素，料液比（g/mL）为1 ∶20，萃取温度为80 ℃，萃取时间为2.0 h 时，提取率可达到0.32 mg/g，纯度可达到67.86%。该方法节省溶剂，操作简单，工艺流程短，提取率高，含杂质少，残渣少，耗能小，符合绿色环保、可持续发展原则，经济和社会效益显著，具有省工省时、便于工业化生产的优点。