p16、Ki⁃67检测在宫颈上皮内瘤变诊断及宫颈癌筛查中的价值

陈炜 周宁 廖茜 彭君臣

作者单位：1.四川绵阳四○四医院妇科，四川，绵阳621000

2.四川绵阳四○四医院病理科，四川，绵阳621000

上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neo⁃plasia，CIN）是一组与宫颈浸润癌密切相关的癌前期病变的统称，反映了宫颈癌发生中连续发展的过程［1⁃2］。大部分低级别CIN 可自然消退，但高级别具有癌变潜能。宫颈癌发病隐匿、疾病进展缓慢，早期无特异性临床症状，为早期预防、诊治带来一定困难［3］。因此，在宫颈癌前病变阶段检出反映病变进展的标志物，对宫颈癌的早期防治具有重要意义［4］。细胞增殖失控是发生恶性病变的重要原因，抑制基因蛋白16（Suppressor gene protein 16，p16）为细胞周期蛋白激酶的抑制因子，p16⁃Cy⁃clinD1⁃CDK⁃Rb 组成的调控途径与宫颈肿瘤的发生有关［5］。原癌基因细胞增殖核抗原（nuclcar⁃as⁃sociated antigen，Ki⁃67）是一种核蛋白，在维持细胞增殖活性中具有重要作用［6］。本组研究通过检测p16、Ki⁃67 在CIN 及宫颈癌中的表达，探讨其在诊断CIN 及宫颈癌筛查中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2017年4月至2020年4月活检或手术切除的子宫颈组织标本共106 例。纳入标准：①年龄大于25 岁以上女性；②临床病历资料完整；③已婚或有过性生活；④均符合CIN 及宫颈癌的诊断标准［7］，且病理结果经2 位或以上经验丰富的病理科医师确诊。排除标准：①孕妇、产妇及哺乳期妇女；②合并其他恶性疾病者；③术前接受放疗、化疗者；④标本信息不全的标本。

最终共纳入81 例，平均年龄为（45.87±13.52）岁。其中CIN 共54 例（Ⅰ级21 例，Ⅱ级18 例，Ⅲ级15 例），宫颈癌13 例（组织学分级：Ⅰ级6 例，Ⅱ级5 例，Ⅲ级2 例），正常宫颈黏膜上皮14 例。

1.2 方法

采用S⁃P 免疫组化染色，标本均用甲醛溶液浸泡，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，4.0 μm 厚度连续切片。然后根据S⁃P 免疫组化染色法对p16、Ki⁃67 进行检测。主要试剂：鼠抗人p16 单克隆抗体、鼠抗人Ki⁃67 单克隆抗体，上述抗体及SP 法超敏试剂盒均由福州迈新生物技术开发公司生产。检测过程严格按照说明进行。一抗阴性对照使用PBS（磷酸盐缓冲液）进行代替。

染色结果判断［8］：p16、Ki⁃67 阳性存在于细胞核或细胞浆内，以棕黄色颗粒为主。结果根据阳性细胞百分比、染色强度综合判定。阳性细胞百分比：无阳性细胞0 分，阳性细胞<10% 1 分，阳性细胞10%～50%2 分，阳性细胞50%～75%3 分，阳性细胞≥75% 4 分。染色强度判定：无色0 分，淡黄色1 分，棕黄色2 分，棕褐色3 分。通过上述两项评分的乘积来综合判定结果：0～3 分为阴性（-），4～5 分为弱阳性（+），6～7 分为中度阳性（++），8～12 分为强阳性（+++）。

1.3 观察指标

比较CIN、宫颈癌、正常宫颈黏膜上皮p16、Ki⁃67 免疫组化结果；分析p16、Ki⁃67 及两者联合检测鉴别诊断CIN、宫颈癌、正常宫颈黏膜上皮的敏感性、特异性及准确性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析；计数资料采用n（%）表示，行χ2检验；不同组织p16、Ki⁃67 表达采用秩和检验；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIN、宫颈癌、正常宫颈黏膜上皮中p16、Ki⁃67 表达情况

在不同组织类型中，p16、Ki⁃67 阳性表达率（P<0.05）。CIN 中，p16、Ki⁃67 阳性表达率随CIN等级增加而上升（P<0.05）。见表1。

表1 CIN、宫颈癌、正常宫颈黏膜上皮中p16、Ki⁃67 表达情况［n（%）］Table 1 expression of p16、Ki⁃67 in CIN，cervical cancer and normal cervical epithelium［n（%）］

2.2 p16、Ki⁃67 及两者联合检测鉴别诊断CIN、宫颈癌的价值

p16 鉴别诊断CIN、宫颈癌的敏感性与Ki⁃67 比较差异无统计学意义（P>0.05），但p16+Ki⁃67 联合诊断的敏感性高于单独的p16、Ki⁃67 检测，差异有统计学意义（χ2=6.500、4.887，P=0.011、0.027）。三种检测方法的特异性数据比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 p16、Ki⁃67 检测鉴别诊断CIN、宫颈癌的价值［n（%）］Table 2 the value of p16，Ki⁃67 in differential diagnosis of CIN and cervical cancer［n（%）］

2.3 3 种检测方法效果评价

采用ROC 曲线分析p16、Ki⁃67 及两者联合检测对CIN、宫颈癌鉴别诊断价值，各指标曲线下面积分别为0.751、0.675 及0.769，其中以联合检测的预测价值最佳。见图1。

图1 3 种检测方法的ROC 曲线Figure 1 ROC curve of 3 detection methods

3 讨论

宫颈癌又称为子宫颈癌，系指发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及宫颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤。相关研究显示，宫颈癌主要是由高危型HPV 导致宫颈鳞状上皮发生异型增生引起，由CIN 等癌前病变长期发展形成，但并非所有的CIN 都会发展为癌，且CIN 发展为癌的过程较长［9。因此，正确预测CIN 的发展，对宫颈癌早期防治和预防CIN 患者过度治疗具有重要意义。

p16 是在人染色体9p21 中发现的一个直接参与细胞周期调控的抑癌基因。对于正常细胞的HPV 一过性感染，检测不到p16 表达；而在HPV 转化性感染后，可使抑癌基因失活，致癌基因E6和E7过表达，细胞无限制增殖，引起p16 的过度表达，并被免疫组化检测到［10］。Ciesielska 等［11］报道指出，CIN 和宫颈癌中网膜母细胞基因的失活会导致p16 表达升高。本组研究结果提示p16 高表达参与宫颈上皮内瘤变到癌的演进过程，故连续监测p16 表达可有效反映宫颈黏膜病变进展情况。

Ki⁃67 的表达出现于除G0和G1早期之外的细胞周期中，细胞有丝分裂后其蛋白含量迅速减少，是全面反映细胞群增殖活性的可靠指标［12］。高度增生的细胞多与癌前病变组织及恶性组织相关，增生常被认为是生长紊乱的早期指标［13］。Ki⁃67 是目前已知的增殖抗原中最具增殖能力代表性，且应用广泛的细胞增殖标记之一［14］。本组研究中，Ki⁃67阳性表达率随宫颈病变严重程度加重而增高，提示在宫颈癌发生发展过程中，细胞增殖活性也逐渐增强。因此Ki⁃67 可作为预测CIN 和宫颈癌发生、发展过程中的重要标记物。

Ovestad I 等［15］研究发现，增加p16 免疫组化染色结合HE 切片，可提高高级别CIN 的诊断准确性、敏感性。病理学专家在诊断高级别CIN 中，发现p16 染色表现的重复性极好，可明显改善宫颈组织病理的常规诊断［16］。本组研究结果发现p16+Ki⁃67联合诊断的敏感性高于单独的p16、Ki⁃67 检测。由此可见单一的p16 用于诊断宫颈病变误诊率较小，但存在一定漏诊率，因此认为p16 染色不适用于早期发现宫颈病变。而单一的Ki⁃67 在诊断宫颈病变上漏诊率较小，但误诊率高，而联合两种标记物能有效提高诊断的可靠性。

综上所述，p16、Ki⁃67 阳性表达率随宫颈病变严重程度加重而增高，两者联合检测可有效区分不同等级CIN 及宫颈癌，可作为宫颈癌前病变进展的一个敏感标志物，能准确识别高级别CIN 病变并及时治疗，阻断宫颈癌变进程，为临床早期预防、诊治宫颈癌前病变及宫颈癌提供了可靠的理论依据。