温胆汤通过CASPR3改善精神分裂症大鼠的认知障碍

郭育君 周旭辉 易新宇 杨俊 张雪花 侯超

摘要 目的：探討温胆汤通过接触蛋白相关蛋白3（CASPR3）对精神分裂症大鼠认知障碍的影响。方法：将SD大鼠随机分为正常组，模型组以及观察组，其中模型组大鼠腹腔注射MK-801 0.6 mg/kg诱导精神分裂症模型。观察组大鼠灌胃温胆汤20 mL/kg，模型组和正常组大鼠灌胃生理盐水20 mL/kg。采用刻板行为评分方法评定建模后5 min、10 min大鼠的刻板行为评分;采用谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等试剂盒检测大鼠血清GSH-Px、CAT以及SOD的含量;采用TUNEL法检测大鼠大脑皮质神经元凋亡率;采用Morris水迷宫测试大鼠的学习记忆功能。采用Western blotting检测大鼠海马组织CASPR3蛋白的表达水平。结果：模型组大鼠在建模后5 min、10 min的刻板行为评分，平均逃避潜伏期，神经元凋亡率以及CASPR3蛋白表达较正常组升高（P<0.05），而观察组大鼠低于模型组（P<0.05）;模型组大鼠血清GSH-Px、CAT和SOD含量较正常组降低（P<0.05），而观察组高于模型组（P<0.05）。结论：温胆汤可改善大鼠的认知障碍，其作用机制可能与下调CASPR3蛋白的表达相关。

关键词 温胆汤;CASPR3;精神分裂症;认知障碍;氧自由基;凋亡

Wendan Decoction Improves Cognitive Disorder in Schizophrenic Rats through CASPR3

GUO Yujun1，ZHOU Xuhui1，YI Xinyu2，YANG Jun1，ZHNAG Xuehua1，HOU Chao1

（1 Department of Alcohol and Internet Addiction Psychiatry，Brain Hospital of Hunan Province，Changsha 410007，China; 2 Department of Chinese Traditional Rehabilitation Medicine，School of Medicine，Loudi Vocational and Technical College，Loudi 410007，China）

Abstract Objective：To explore the effect of Wendan Decoction on cognitive disorder in schizophrenic rats through contactin associated protein 3 （CASPR3）.Methods：SD rats were randomly divided into a normal group，a model group and an experimental group.In the model group，the rats were intraperitoneally injected with 0.6 mg/kg MK-801 to induce a schizophrenia model.The rats in the experimental group were intragastrically administrated with 20 mL/kg Wendan Decoction，and the rats in the model group and the normal group were intragastrically administrated with 20 mL/kg normal saline.The stereotyped behavior scoring method was used to evaluate the stereotyped behavior scores of the rats 5 and 10 min after modeling.Glutathione peroxidase （GSH-Px），catalase （CAT），superoxide dismutase （SOD） kits were used to detect rat serum GSH-Px，CAT and SOD content.The TUNEL method was used to detect the apoptosis of cerebral cortex neurons in rats.Morris water maze was used to test the learning and memory function of rats.Western blotting was used to detect CASPR3 protein expression in rat hippocampus.Results：The stereotyped behavior scores，average escape latency，neuronal apoptosis rate，and CASPR3 protein expression of rats in the model group were higher than those in the normal group at 5 min and 10 min after modeling （P<0.05），while those of the rats in the experimental group were lower than those in the model group （P<0.05）.The levels of serum GSH-Px，CAT and SOD in the model group were lower than those in the normal group （P<0.05），while those in the experimental group were higher than those in the model group （P<0.05）.Conclusion：Wendan Decoction can reduce the cognitive disorder of rats.Its mechanism may be related to the down-regulation of CASPR3 protein expression.

Keywords Wendan Decoction; CASPR3; Schizophrenia; Cognitive disorder; Oxygen free radical; Apoptosis

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.012

精神分裂症（Schizophrenia，SCZ）是一种终身性疾病，全球人群患病率达1%，多发于青壮年;认知障碍是SCZ的一大核心症状，主要特征为工作学习记忆力下降，执行功能障碍，言语障碍等[1-2]。温胆汤是临床上用于“无形之痰”所致的精神疾病，具有理气化痰、和胃利胆的功效，已有研究表明其可改善SCZ大鼠学习记忆障碍、抗氧化损伤以及海马组织病理损伤等，对SCZ具有保护作用[3-4]。然而温胆汤改善SCZ大鼠认知障碍的机制尚不清楚。接触蛋白相关蛋白3（CASPR3）是一种神经细胞黏附因子，有研究发现其在新生小鼠基底神经节中表达，可参与调节大脑皮质的神经活动[5];既往研究表明CASPR3与SCZ的发生发展密切相关，其在SCZ患者中高表达，使用抗精神病类药物治疗后可恢复至正常水平[6]。本研究通过构建SCZ大鼠模型，探讨温胆汤对SCZ大鼠认知障碍的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 30只清洁级雌性SD大鼠，5～6周龄，体质量（200±20）g，购自湖南嘉泰实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2020-0006。于室温22～25 ℃，湿度50%～65%，自然光照，给予充足的饮水和摄食，适应新环境5 d后进行实验研究。对大鼠的护理和使用根据国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》中的指导原则，并得到湖南省脑科医院动物实验伦理审查委员会的批准（伦理审批号：202001005）。

1.1.2 药物 温胆汤处方组成：半夏6 g、茯苓4.5 g、枳实6 g、竹茹6 g、陈皮9 g、生姜3片、红枣2枚、炙甘草3 g，购自湖南省中医院中药房。将所有药物浸泡后，首次加药材量的8倍水沸腾后煎煮40 min，第2次加药材量的6倍水煎煮30 min，逐次过滤，合并2份药液后浓缩，于4 ℃冰箱保存备用。地卓西平（MK-801），规格：10 mg/mL，批号：77086-22-7，批准文号：H20080411，购自美国Sigma公司。

1.1.3 试剂与仪器 一抗CASPR3抗体（1∶1 000，货号：ab198853）、GAPDH（1∶2 000，货号：ab8245）和二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）（1∶2 000，货号：ab6721）购自上海Abcam公司;化学发光（ECL）试剂盒（常州天地人和生物科技有限公司，货号：H30100）;聚氰基丙烯酰正丁酯（BCA）蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0146）;谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）（上海研谨生物科技有限公司，货号：YJS2294）;过氧化氢酶（CAT）（上海齐源生物科技有限公司，货号：QYS-23030）;超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（上海研卉生物科技有限公司，货号：11305）;原位末端标记法（TUNEL）细胞凋亡试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号：GS0248）;Morris水迷宫（江苏塞昂斯生物科技有限公司，型号：SA201）;低温高速离心机（Sigma公司，美国，型号：3K30）;电泳仪（北京百思佳特科技有限责任公司，型号：xt51752）;转膜仪（南京中科通仪科技有限公司，型号：TY-201-01）;DMEM完全培养基（含10%胎牛血清）（深圳百恩维生物科技有限公司，型号：BW120013）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将30只大鼠随机分为正常组，模型组和观察组，每组10只。模型组大鼠腹腔注射MK-801 0.6 mg/kg诱导精神分裂症模型。建模后以刻板行为评分方法评定各组大鼠刻板行为的改变，0分以上表示造模成功[7]。

1.2.2 给药方法 观察组大鼠灌胃服用温胆汤20 mL/kg，模型组和正常组大鼠灌胃服用生理盐水20 mL/kg。1次/d，连续干预14 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 大鼠刻板行为评分 在造模成功后的5 min、10 min以刻板行为评分方法评定各组大鼠刻板行为的评分，评分标准：0分，与生理盐水作用无区别;1分，动物不连续地闻，常伴有兴奋活动;2分，动物连续地闻，头稍有活动，伴有周期性兴奋活动;3分，动物连续地闻、头部活动多，伴有不连续地咬、啃、舔动作，并伴有短暂的兴奋期;4分，动物连续地咬、啃和舔，无兴奋活动期，有时全身迅速移位[8]。

1.2.3.2 大鼠定位航行實验 在进行定位航行实验前，先将大鼠逐一放入Morris水迷宫中（无平台）自由游泳3 min，熟悉适应环境，定位航行试验历时5 d，设定逃避潜伏期为60 s，每天随机选取入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录其逃避潜伏期，即从入水到找到隐藏在水面下平台的时间。

1.2.3.3 大鼠体内氧自由基含量检测 大鼠腹主动脉取血6 mL，离心后取血清，使用GSH-Px、CAT、SOD检测试剂盒并根据操作说明，检测各组大鼠血清GSH-Px、CAT、SOD含量。

1.2.3.4 TUNEL染色实验检测神经元凋亡率 取大鼠脑组织，将大脑皮质剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化10 min，终止消化后在DMEM完全培养基中吹打成细胞悬液，静置取上清液，收集细胞。用PBS洗涤细胞，5%多聚甲醛固定5 min，再用PBS冲洗，用蛋白酶K 20 μg/mL消化30 min，PBS冲洗细胞3次，5 min/次，再用3% H2O2和0.1%Triton X-100培养10 min，之后使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒染色，最后用DAPI标记1 min，37 ℃避光孵育1 h。细胞核染为绿色为凋亡细胞，荧光显微镜下计数凋亡细胞数和总细胞数，计算每组细胞的凋亡率。细胞凋亡率=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

1.2.3.5 Western blotting检测CASPR3蛋白表达情况 取各组大鼠大脑海马组织，提取总蛋白后，采用BCA试剂盒定量，将蛋白转移至PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭后加入一抗和二抗室温孵育2 h，检测各组CASPR3蛋白表达，以GAPDH作为内参。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析数据，刻板行为评分以及Morris水迷宫数据等计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，当数据符合正态分布时，采用Dunnet检验;数据不符合正态分布时，采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠刻板行为评分结果 模型组大鼠的刻板行为评分较正常组升高（P<0.05）;观察组大鼠的刻板行为评分较模型组降低（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠定位航行实验结果 与正常组比较，模型组大鼠的平均逃避潜伏期显著延长（P<0.05）;与模型组比较，观察组大鼠的平均逃避潜伏期显著缩短（P<0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠血清氧自由基含量 与正常组比较，模型组大鼠血清GSH-Px、CAT和SOD含量较正常组显著降低（P<0.05）;观察组大鼠血清GSH-Px、CAT和SOD含量较模型组显著升高（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠神经元凋亡率 与正常组比较，模型组大鼠大脑皮质神经元凋亡率显著增加（P<0.01）;与模型组比较，观察组大鼠大脑皮质神经元凋亡率显著降低（P<0.01）。见表4，图1。

2.5 各组大鼠海马组织CASPR3蛋白的表达水平  模型组大鼠海马组织中的CASPR3表达水平较正常组显著升高（P<0.05）;观察组大鼠海马组织中的CASPR3表达较模型组显著降低（P<0.05）。见表5和图2。

3 讨论

SCZ在中医学属于“癫狂”范畴，早在《黄帝内经》时期就有其症状记载，如《灵枢·经脉》：“善恐，心惕惕如人将捕之，喜笑不休，恶人与火，惕然而惊”[9]。现代病理学研究表明，氧自由基可介导SCZ患者中枢神经系统功能缺陷，而机体清除氧自由基的速率取决于GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶的活性[10-11]。温胆汤出自唐代孙思邈《备急千金药方》，汤中半夏为君药，和胃降逆，燥湿祛痰;陈皮、生姜为臣药，理气和胃、化濕祛痰;竹茹、枳实为佐药，涤痰开郁，清热止呕;甘草调和诸药[12-13]。有研究发现，温胆汤可通过上调PI3K、Akt、GSK3β蛋白的表达，调控PI3K/Akt/GSK3β信号通路，降低SCZ大鼠的刻板行为评分，从而发挥对SCZ的保护作用[3，14]。本研究通过给予MK-801诱导SCZ大鼠模型，而后给予温胆汤20 mL/kg治疗，结果显示温胆汤温胆汤可改善SCZ大鼠的刻板行为、学习记忆能力以及大鼠皮层神经元的凋亡率，并加大清除大鼠体内氧自由基，减轻过氧化损伤。

CASPR3是一种在人脑组织中均有表达的跨膜蛋白，可作用于神经系统细胞间通信和膜运输的生理过程[15-16]。既往研究发现CASPR3在脑功能中发挥作用，与运动控制和学习有关[17];此外，CASPR3在SCZ患者白细胞中高表达，并参与大脑神经网络的构建和循环白细胞的自噬，其高表达可能与SCZ发病有关[18];本研究同样显示SCZ大鼠海马组织中CASPR3蛋白的表达水平显著升高，这提示了CASPR3在SCZ大鼠海马组织中表达异常，并可参与SCZ的病理损伤过程;而给予温胆汤治疗后，CASPR3蛋白表达水平显著降低，这说明温胆汤可显著抑制CASPR3蛋白的表达。

综上所述，本研究证实温胆汤可通过CASPR3改善SCZ大鼠的认知障碍，该研究为温胆汤用于SCZ大鼠提供理论依据。

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（2021-03-08收稿 责任编辑：王明）