肺转移前微环境体外模型的建立与双参颗粒干预机制

魏华民 俞静 郭秋均 刘瑞 花宝金

摘要 目的：構建肺转移前微环境体外模型，观察S1pr1-stat3信号通路在模型成熟过程中的作用，同时验证双参颗粒对该模型的干预作用，探讨其可能的机制。方法：体外构建小鼠Lewis肺癌细胞和原代骨髓细胞共培养模型，并用S1pr1激活剂SEW2871干预髓系细胞分化的过程，观察相关蛋白MMP9、Lox、Version及Fibronectin的表达情况，并检测模型中骨髓来源的抑制性细胞（MDSCs）细胞的分化情况及双参颗粒对模型的干预效果。结果：S1pr1可以明显促进肺转移前微环境体外模型的成熟构建，S1pr1-stat3是该模型成熟的关键信号通路，双参颗粒不仅显著降低模型中该信号通路相关蛋白的表达，同时对微环境成熟的关键蛋白的表达也具有抑制作用，还可显著降低该信号通路相关的骨髓细胞向MDSCs细胞的分化（P<0.05），同时对转移前微环境中部分肿瘤源性细胞因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及转化生长因子（TGF-β）有显著抑制作用（P<0.05）。结论：双参颗粒通过抑制S1pr1-stat3信号通路及部分肿瘤源性细胞因子的表达，抑制肺转移前微环境模型的成熟。

关键词 肺转移前微环境;双参颗粒;体外模型;小鼠;S1pr1-stat3信号通路

Establishment of an in Vitro Model of Microenvironment before Lung Metastasis and the Intervention Mechanism of Shuangshen Granule

WEI Huamin1，YU Jing1，GUO Qiujun2，LIU Rui2，HUA Baojin2

（1 Beijing Friendship Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China; 2 Guang′an Men Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Abstract Objective：To establish an in vitro model of microenvironment before lung metastasis，and explore the efficacy of S1pr1-stat3 signaling pathway in the mature process and at the same time to verify the intervention effect of Shuangshen Granule （SSG） on the model，and explore its potential mechanism.Methods：Mouse Lewis lung cancer cells and primary bone marrow cells were co cultured in vitro and the differentiation of bone marrow cells were intervened by s1pr1 activator Sew2871.The expression of MMP9，LOX，Version and Fibronectin，and the differentiation of MDSCs cells of the model were observed and the intervention effect of SSG on the model were detected.Results：S1pr1 could significantly promote the construction of the in vitro model of microenvironment before lung metastasis，and S1pr1-stat3 was the key signal pathway for the maturation of the model.SSG not only significantly reduced the expression of the signal pathway related proteins in the model，but also inhibited the expression of key proteins in microenvironment maturation，and significantly reduced the differentiation of bone marrow cells to MDSCs under the effect of signal pathway （P<0.05）.Meanwhile，it also significantly inhibited some tumor-derived cytokines such as GM-CSF and TGF-β in the pre metastasis model （P<0.05）.Conclusion：Shuangshen Granule can inhibit the maturation of the pre-lung metastasis microenvironment model before lung metastasis by inhibiting the expression of s1pr1-stat3 signal pathway and some tumor-derived cytokines.

Keywords Pre-lung metastasis microenvironment; Shuangshen Guanule; In vitro model; Mouse; S1pr1-stat3 signaling pathways

中图分类号：R273;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.06.009

肺癌的复发和转移的预防是肺癌患者治疗的重点。近年的研究发现，肿瘤细胞成功转移前就会通过某些机制在靶器官或组织形成特定的转移前微环境，以利于肿瘤细胞的种殖和转移[1-3]。转移前微环境中的细胞组分如骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived Suppressor Cells，MDSCs）细胞和一些关键蛋白的表达在微环境成熟的过程中起到关键作用[4-6]。通过干预转移前微环境的成熟以抑制肿瘤细胞种殖及转移成为近年抗肿瘤转移领域的研究热点[1-2，7]。本研究通过构建肺转移前微环境体外模型观察双参颗粒的相关干预作用及探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量（20±2）g，6～8周龄，由中国中医科学院广安门医院动物房负责饲养（饲养温度控制在18～22 ℃，湿度50%～60%，12 h昼夜节律灯光，自由摄食和饮水）。Lewis细胞购买自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，在中国中医科学院广安门医院肿瘤实验中心细胞培养室进行培养（CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5%CO2）。

1.1.2 药物 双参颗粒组成药物包括：西洋参、冬虫夏草、三七（1∶1∶6），3种中药饮片均由中国中医科学院广安门医院中药房提供（康美制药厂，产品批号：三七412041;冬虫夏草：121281481;西洋参：14110804），干燥后用无菌粉碎机进行粉碎并过100目筛备用，将3种药物粉末按比例混合后，并按照文献及卫生质量符合2000版《中华人民共和国药典》标准对其行紫外线联合75%乙醇灭菌。SEW2871购自Santa Cruz公司，CAS号为256414-75-2，规格为5 mg。氟尿嘧啶注射液（以下简称5-Fu）（上海旭东海普药业有限公司，批号：H31020593）。

1.1.3 试剂与仪器 Anti-fibronectin antibody（Abcam公司，英国，货号：Ab2413），Anti-MMP9 antibody（Abcam公司，英国，货号：Ab38898），Anti-versican antibody（Abcam公司，英国，货号：Ab19345），Anti-LOX antibody（Abcam公司，英国，货号：Ab31238），鼠VEGF ELISA试剂盒（Abcam公司，英国，货号：Ab209882），鼠TGF beta 1 ELISA试剂盒（Abcam公司，英国，货号：Ab119557），鼠GM-CSF ELISA试剂盒（Abcam公司，英国，货号：Ab201276）及鼠TNF-alfa ELISA试剂盒（Abcam公司，英国，货号：Ab100747）。β-actin（ImmunoWay Biotechnology公司，美国，YT0099）.鼠MS CD45 PE MAB 0.1MG 30-F11（Becton，Dickinson and Company，美国，货号：553081），MS CD11B APC MAB 0.1MG M1/70（Becton，Dickinson and Company，美国，货号：553312），MS CD16-CD32 PURE MAB 0.1MG 2.4G2（Becton，Dickinson and Company，美国，货号：553141）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 分组：本实验体外模型阶段按照肺细胞和MDSCs的比例分别为1∶0，1∶0.3，1∶0.6，1∶1，0∶1分为5组，均为正常培养，未与药物干预。髓系细胞向MDSCs分化过程分为6组分别为正常组，培养24 h组，培养96 h组，Sew2871组，双参颗粒组，5-Fu组。药物干预体外模型分为3组即正常组，Sew2871组，双参颗粒组。

小鼠肺单细胞悬液制备：1）采用颈椎脱臼法处死小鼠。2）在超净台中，75%的医用乙醇消毒小鼠全身皮肤，无菌操作打开胸腔取出肺脏。3）将肺脏移入无菌平皿中，并用无菌PBS清洗肺脏表面血液，去除可见的气管组织。4）根据需要，取适量肺组织，用无菌眼科剪将其剪碎，用匀浆机匀浆1 min。5）将剪碎的组织加入预热至37 ℃的新鲜配制的胶原酶V消化液中（175 U/mL），放入37 ℃的恒温箱中消化1 h，每3～5 min轻轻振摇1次。6）将消化后的肺组织用200目滤网过滤。7）将滤液离心（1 000 r/min，离心半径8 cm，5 min），去上清，用PBS洗一遍并离心去上清。8）将离心后的细胞加入2 mL红细胞裂解液，常温孵育1 min，离心去上清。9）重复第7步2遍。10）加入含1%的胎牛血清的PBS 1 mL得到鼠肺单细胞悬液。

MDSCs细胞制备和分选：1）取正常C57BL/6小鼠颈椎脱位处死后，浸泡于盛有75%乙醇的广口瓶内15 min。2）沿小鼠下肢根部剪下双下肢，浸泡于RPMI-1640培养基中，无菌剥离下肢肌肉组织，取出股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。3）用1 mL注射器吸取RPMI-1640培养基冲刷骨髓腔，反复3～5遍，直至骨头变白。4）收集培养皿中的骨髓细胞悬液于离心管内，1 500 r/min，10 min离心，离心半径8 cm，弃去上清。5）先用振荡器稍混匀沉淀细胞，再向其内加入2 mL红细胞裂解液（室温）以溶解红细胞，室温静置2 min后加入15 mL RPMI-1640培养基终止反应，1 500 r/min×5 min离心;离心半径8 cm，弃去上清。6）将得到的髓系细胞在体外加入IL6和GM-CSF（浓度均为10 μg/mL）进行体外培养1周。7）MDSCs分选：按照美天旎Myeloid-derived suppressor cell isolation kit进行MDSCs分选。步骤如下：用MACS专用缓冲液重悬细胞，加anti-Gr-1-biotin，4 ℃放置15～20 min，PBS洗2遍，MACS专用缓冲液重悬细胞，加亲和素（Streptavidin）耦联的免疫磁珠，4 ℃放置15～20 min，然后進行阳性选择分离，FACS分析，CD11b+Gr-1+MDSC>90%。

共培养技术构建转移前微环境体外模型构建：在transwell小室中上室加入Lewis细胞3×105个（加入sew2871激活s1pr1受体1 μg/mL），下室加入按比例混匀的肺单细胞悬液和MDSCs的混合物（1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶1、0∶1）使下室细胞总数为3×105个。培养24 h后，对下室内容物进行转移前微环境标志物检测。

1.2.2 给药方法 药物干预体外模型分为3组即正常组，Sew2871组（给予Sew2871，1 μg/mL），双参颗粒组（给予双参颗粒5 mg/mL）。MDSCs分化试验分为6组即正常组、正常组培养24 h、正常组培养96 h、阳性对照组培养96 h（给予sew2871，1 μg/mL）、双参颗粒（shuangshen）加SEW2871共培养96 h组、5-Fu加SEW2871共培养96 h组（给予5-氟尿嘧啶0.6 μg/mL）。

1.2.3 检测指标与方法 首先，我们Western blotting法检测转移前微环境模型中Fibronectin、Lox、Version及MMP9的表达水平，以评估模型的成功建立;其次用流式细胞仪检测S1pr1激活后髓系细胞向MDSC分化的效率及双参颗粒对该过程的干预效果;然后用Western blotting法检测共培养模型中S1pr1-stat3信号通路及各标记物的表达;最后用ELISA法检测细胞培养液中肿瘤生长因子-β（TGF-β）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-GSF）、血管内皮生长因子（VEGF）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行多组之间的数据比较，用ANOVA方法进行方差齐性检验，并用SNK法进行两两比较，并用Prism 6.0软件作图，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺转移前微环境体外模型的构建 结果发现，当肺细胞和MDSCs细胞比例为1∶1时，各个肺转移前微环境的成熟蛋白标志物表达最高。见图1。

2.2 双参颗粒对肺转移前微环境体外模型的细胞组分影响 结果发现：正常C57小鼠骨髓组织中MDSCs细胞含量较低，约为0.1%左右（图2A），当加入刺激剂（IL-6和GM-CSF）后，随时间延长，MDSCs的分化效率不断增加（图2B），但仍效率低下，在96 h时MDSCs的转化效率也为5%左右（图2C）。当加入s1pr1激动剂sew2871激活的Lewis共培养后转化效率明显增加，4 d转化效率约43%左右（图2D），同期无论给予双参颗粒醇提剂还是5-Fu（阳性对照组），都会明显降低髓系细胞向MDSCs的分化（图2G）。

2.3 双参颗粒对肺转移前微环境中关键信号通路及标志蛋白的影响 实验结果显示，双参颗粒对SEW2871激活的s1pr1及stat3有显著的抑制作用（P<0.05）。同时也对SEW2871激活的s1pr1带来的转移前微环境标志物成熟具有抑制表达的作用（P<0.05）。

2.4 双参颗粒对肺转移前微环境中炎症介质的影响 实验检测了共培养模型中12 h、24 h共培养上清液中TDSFs的水平，发现共培养12 h各组TDSFs较对照组无显著变化（P>0.05）。24 h后TGF-β及GM-CSF在双参颗粒组有显著降低（P<0.05），VEGF和TNF-α无显著变化。5-Fu对各种TDSFs均无显著抑制作用。

3 讨论

本研究发现，双参颗粒对S1pr1-stat3信号通路激活所诱发的转移前微环境逐渐成熟及髓系细胞分化导致的转移前微环境免疫抑制细胞组分具有明显地抑制作用，这可能是双参颗粒干预肺转移前微环境抗肺癌转移的机制之一。

转移前微环境是肿瘤细胞远端转移的重要基础[3，8]。一些关键蛋白如Fibronecin、Lox、MMP9及Version等逐渐高表达是转移前微环境逐渐成熟的标志[9-10]。成功的构建肺转移前微环境是研究其内在机制，制定预防或阻断肺癌转移的必要前提。我们前期的实验已经成功的在荷瘤小鼠体内构建转移前微环境模型，并发现该药可以通过干预微环境的成熟起到抗肺癌转移的作用[11]，为进一步研究双参颗粒干预转移前微环境的分子机制，本实验利用共培养技术构建了体外肺转移前微环境模型。根据国外学者关于转移前微环境的研究，发现MDSCs在肺中的比例最高可达到50%左右[12]，所以我们设计了不同比例的配比浓度，发现肺细胞和MDSCs比例为1∶1时，各种转移前微环境特异性生物标志物表达水平较高，和国外的动物实验基本一致。转移前微环境体外模型的建立不仅有利于研究药物对转移前微环境的影响，同时对相关信号通路的激活研究也有重要意义。

既往的研究发现，S1PR1-stat3信号通路在肺转移前微环境的形成中起到了重要作用[10，13-15]。本实验通过使用S1pr1的激动剂SEW2871，并利用Western blotting技术进行微环境成熟相关的关键蛋白验证，成功的构建了S1pr1-stat3信号通路激活的肺转移前微环境，这和既往的体内研究结果一致[16]。Deng等[10]的研究发现，S1pr1的激活是stat3蛋白在转移前微环境中持续表达的关键因素，也是微环境逐步成熟的前提。通过干预S1pr1相关信号通路达到抗肿瘤转移的目的也是国外研究的热点之一[15]。本研究发现双参颗粒对S1pr1及其下游stat3的表达有显著的抑制作用，并通过干预该信号通路对髓系细胞的分化也起到抑制作用，可明显地减少髓系细胞向MDSCs细胞的分化，而MDSCs细胞被认为是肺转移前微环境形成过程中的关键细胞组分，通过抑制关键信号通路从而抑制骨髓细胞的分化可能是双参颗粒抗肺癌转移的重要分子基础。

原位肿瘤通过分泌多种可溶性分子为转移前微环境的形成制备较适宜的远端器官局部环境，从而为促进转移甚至是决定其转移器官靶向性都起到了关键作用。这些可溶性分子包括肿瘤源性分泌因子（TDSFs）、胞外囊泡（EVs）及其他分子。已证实多种TDSFs可通过直接动员和招募骨髓中的髓系细胞来促进转移前微环境形成，其中包括血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转录生长因子-β（TGF-β）等，TDSFs还可通过旁分泌的方式激活原位肿瘤微环境中的髓系细胞迁移和功能，促进其在转移前微环境的种殖，从而成为构建转移前微环境的关键[4，17-19]。本实验证实，双参颗粒可以显著降低肺转移前微环境模型中部分TDSFs，这不仅从另一个侧面证实了双参颗粒对肿瘤细胞塑造转移前微环境具有干预作用，同时也为进一步拓展中医理论，完善中医处方提供了参考，由于中药的多靶点的特点，很难对某一特殊位点或因子的释放达到完全抑制，但可以通過适当配伍以增强其抑制效果，从而带来更好的疗效，如何进一步完善配方是未来研究的重要方向。

關于双参颗粒的药效学基础，既往的实验发现，该药组分中的诸多单体对stat3相关的信号通路均有抑制作用，如三七皂苷R1，Panaxadiol，人参皂苷compound K，人参皂苷Rk1都对Stat3蛋白的表达具有一定的调节作用[20-23]。而关于其组分中抑制骨髓细胞分化的相关研究目前尚少，本研究也是首次发现双参颗粒对骨髓细胞的分化具有一定的调节作用，其具体的有效单体有待于后续研究。

本研究的对于中药抗肿瘤转移的研究具有重要参考价值，首先，目前尚缺乏系统的抗肿瘤转移的相关中医理论，双参颗粒是在花宝金教授“扶正调气”治肿瘤的理论指导下组建的方药[24]，间接说明益气活血法对肿瘤转移具有一定的预防作用，同时借用现代研究成果将中医治疗肿瘤转移的门槛大大前移了，这是对中医“治未病”理论的进一步深化。其次，把中药当成植物药进行研究，集中观察中药对肿瘤细胞本身特性的干预，不仅失去了中医理论的指导与优势，而且期待自然药物演化出胜于化学药物的消瘤特性显然也失去了学科特色，本研究从临床现象归纳出的中医理论出发，从微观角度阐释了益气活血法对转移前微环境干预的分子机制，是对花宝金教授“扶正调气”治肿瘤理论的细化，相信在该理论的指导下进行更多的研究必将丰富和完善中医抗肿瘤的临床实践。

参考文献

[1]Low V，Blenis J，Gomes AP.Targeting the premetastatic niche：epigenetic therapies in the spotlight[J].Signal Transduct Target Ther，2020，5（1）：68.

[2]Lu Z，Zou J，Li S，et al.Epigenetic therapy inhibits metastases by disrupting premetastatic niches[J].Nature，2020，579（7798）：284-290.

[3]Lin Q，Ren L，Jian M，et al.The mechanism of the premetastatic niche facilitating colorectal cancer liver metastasis generated from myeloid-derived suppressor cells induced by the S1PR1-STAT3 signaling pathway[J].Cell Death Dis，2019，10（10）：693.

[4]Liu Y，Cao X.Characteristics and Significance of the Pre-metastatic Niche[J].Cancer Cell，2016，30（5）：668-681.

[5]Wei HM，Hua BJ.Role of myeloid-derived suppressor cells in premetastatic niche formation and tumor metastasis promotion[J].China Oncology，2017，27（6）：516-520.

[6]Erler JT，Bennewith KL，Cox TR，et al.Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche[J].Cancer Cell，2009，15（1）：35-44.

[7]Long Y，Lu Z，Xu S，et al.Self-Delivery Micellar Nanoparticles Prevent Premetastatic Niche Formation by Interfering with the Early Recruitment and Vascular Destruction of Granulocytic Myeloid-Derived Suppressor Cells[J].Nano Lett，2020，20（4）：2219-2229.

[8]Gil-Bernabe AM，Ferjancic S，Tlalka M，et al.Recruitment of monocytes/macrophages by tissue factor-mediated coagulation is essential for metastatic cell survival and premetastatic niche establishment in mice[J].Blood，2012，119（13）：3164-3175.

[9]Psaila B，Lyden D.The metastatic niche：adapting the foreign soil[J].Nat Rev Cancer，2009，9（4）：285-293.

[10]Deng J，Liu Y，Lee H，et al.S1PR1-STAT3 signaling is crucial for myeloid cell colonization at future metastatic sites[J].Cancer Cell，2012，21（5）：642-654.

[11]Wei H，Guo C，Zhu R，et al.Shuangshen granules attenuate lung metastasis by modulating bone marrow differentiation through mTOR signalling inhibition[J/OL].J Ethnopharmacology，2020，113305[2020-09-03].https：//doi.org/10.1016/j.jep.2020.113305.

[12]Gao D，Joshi N，Choi H，et al.Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition[J].Cancer Res，2012，72（6）：1384-1394.

[13]Lee H，Deng J，Kujawski M，et al.STAT3-induced S1PR1 expression is crucial for persistent STAT3 activation in tumors[J].Nat Med，2010，16（12）：1421-1428.

[14]Lankadasari MB，Aparna JS，Mohammed S，et al.Targeting S1PR1/STAT3 loop abrogates desmoplasia and chemosensitizes pancreatic cancer to gemcitabine[J].Theranostics，2018，8（14）：3824-3840.

[15]Rostami N，Nikkhoo A，Ajjoolabady A，et al.S1PR1 as a Novel Promising Therapeutic Target in Cancer Therapy[J].Mol Diagn Ther，2019，23（4）：467-487.

[16]Zhou Y，Guo F.A selective sphingosine-1-phosphate receptor 1 agonist SEW-2871 aggravates gastric cancer by recruiting myeloid-derived suppressor cells[J].J Biochem，2018，163（1）：77-83.

[17]Kaplan RN，Psaila B，Lyden D.Bone marrow cells in the ′pre-metastatic niche′：within bone and beyond[J].Cancer Metastasis Rev，2006，25（4）：521-529.

[18]Costa-Silva B，Aiello NM，Ocean AJ，et al.Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J].Nat Cell Biol，2015，17（6）：816-826.

[19]Chafe SC，Lou Y，Sceneay J，et al.Carbonic anhydrase IX promotes myeloid-derived suppressor cell mobilization and establishment of a metastatic niche by stimulating G-CSF production[J].Cancer Res，2015，75（6）：996-1008.

[20]Zhang X，Zhang S，Sun Q，et al.Compound K Induces Endoplasmic Reticulum Stress and Apoptosis in Human Liver Cancer Cells by Regulating STAT3[J].Molecules，2018，23（6）：1482-1498.

[21]Yu Q，Zeng KW，Ma XL，et al.Ginsenoside Rk1 suppresses pro-inflammatory responses in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells by inhibiting the Jak2/Stat3 pathway[J].Chin J Nat Med，2017，15（10）：751-757.

[22]Lu M，Xie K，Lu X，et al.Notoginsenoside R1 counteracts mesenchymal stem cell-evoked oncogenesis and doxorubicin resistance in osteosarcoma cells by blocking IL-6 secretion-induced JAK2/STAT3 signaling[J].Invest New Drugs，2020，39（2）：416-425.

[23]Wang Z，Li MY，Zhang ZH，et al.Panaxadiol inhibits programmed cell death-ligand 1 expression and tumour proliferation via hypoxia-inducible factor（HIF）-1alpha and STAT3 in human colon cancer cells[J].Pharmacol Res，2020，155：104727.

[24]秦英剛，杜欣颖，花宝金.肿瘤患者无瘤状态的中医诊治思路[J].中医学报，2020，35（10）：2115-2118.

（2020-11-25收稿 责任编辑：王明）