药用植物滇黄精寄生真菌的分离与鉴定

谭 伟，浦仕彪

（云南中医药大学，昆明 650500）

0 引言

滇黄精(Polygonatum kingianum)为百合科黄精属多年草本植物[1]。据《中国药典》2015版记载，黄精为百合科植物滇黄精(Polygonatum kingianum)、黄精(Polygonatum sibiricum)或多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的干燥根茎，滇黄精是中药黄精3种基源植物之一[2]。《中国植物志》记载，滇黄精主要分布于中国西南地区，主产于云南，具有悠久的用药历史[3-4]。现代研究确定滇黄精中含有多糖、甾体皂苷、黄酮、蒽醌类化合物等多种化学成分，具有降血糖、降血脂、抗衰老、提高免疫力、抗炎、抗肿瘤等多种作用[5-8]，因此具有较高的药用价值和保健功效。随着以黄精为主要原料的各类保健酒、饮料、化妆品等养生保健品[9-10]市场需求的不断扩大，黄精的资源压力巨大。滇黄精已在云南多地进行人工栽培，随着种植面积不断扩大，其病害也日益严重。陈泽历等[11]研究认为大面积单一种植滇黄精会导致病害发生变得严重。云南多地为了提高滇黄精的种植效益，对滇黄精的栽培技术进行了研究。尤俊荣等[12]探索云南松林下滇黄精的栽培技术，刀立华等[13]在云南普洱市景谷镇探索山地茶园套种滇黄精。王桥美等[14]发现滇黄精病害主要有黑斑病、叶斑病、软腐病、炭疽病、根腐病等，其病害多为真菌侵染性病害。田启建等[15]发现贵州黄精的主要病害种类为黑斑病、叶斑病和炭疽病，它们的病原均为半知菌亚门真菌。严吉明等[16]对四川省54种药用植物进行病原鉴定，鉴定出病害115种，其中大部分为真菌侵染性病害。黄剑等[17]对贵州省53种药用植物进行病害调查，发现真菌性病害为38种。药用植物主要病害为真菌侵染性病害。该种病原真菌寄生于活体植物，并从宿主摄取营养，在其体内生长繁殖，对宿主产生极大危害，产生一系列病理性症状。许多植物体内除了含有致病性真菌外，还有对植物体有益的内生真菌[18]，它是某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的一类真菌。植物与内生真菌互利共生，内生真菌能增强植物抗病害能力，它分泌的代谢产物能促进植物生长，内生真菌已广泛应用于生物制药、农业等领域[19]。笔者对滇黄精寄生真菌进行分离与鉴定，以期为其病害防治提供理论依据和技术参数。

1 材料与方法

1.1 材料

采集丽江华坪县、丽江玉龙县鲁甸乡的滇黄精全株各12株。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分离与鉴定

（1）样品保湿培养。将进行过表面处理的滇黄精样品按部位切割成大小合适的小样品，置于事先用酒精擦拭过且晾干的保鲜盒中，在盒子的对角处放置大小合适的棉花，并向棉花中滴洒无菌水，直到浸透棉花且不溢出，盖上保鲜盒盖子，时常不断观察直至样品表面长出真菌。

（2）分离和纯化。对长出真菌的样品，于超净工作台上用灭菌接种针挑取少量的菌丝并接种于PDA培养基中，均匀地在培养基上点3个点，并做好标记。此过程可根据样品上有几种不同颜色、形态等明显区分的菌落，挑取对应的皿数。待真菌长出后观察同一皿中颜色、形状等是否有差距，如果有进行下一轮纯化，直至长出的真菌没有污染，属于同一种菌即可。

1.2.2 形态学鉴定 观察并记录PDA培养基中菌落的直径、颜色、形态的变化及生长速度。DNA提取前，在光学显微镜下观察并记录菌丝及孢子形态特征[20-21]。参考《真菌鉴定手册》[22]、《中国真菌志》[23]等，初步鉴定寄生真菌。

1.2.3 分子生物学鉴定 采用CTBA法[24-29]提取真菌基因组DNA。ITS扩增使用的引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3')，两者为通用引物，由昆明擎科生物有限公司合成。50 μL PCR反应体系为10 μL 10×PCR Buffer、0.25 μL dNTPs(10 mmol/L)、1 μL ITS4、1 μL ITS5、0.3 μLTaq酶、1 μLDNA模板，用ddH2O补足50 μL。扩增程序为94℃ 4 min，94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃1 min，33个循环，72℃ 3 min，4℃保存。

扩增产物由昆明擎科生物有限公司测序。测序结果通过Chromas软件校对，以每个形态型菌株的ITS序列作为靶序列，在NCBI的GenBank数据库中通过Blast搜索，将相似度最高的序列作为参考序列。确定序列的有效性；打开序列文件并复制该序列；打开NCBI网站，进入BLAST功能区域选择Nucleotide BLAST；粘贴序列于序列框，输入序列编号，勾选“show results in a window”；点击BLAST；根据ident（百分比）确定所测样品序列的分类地位。RensKe Landeweer等[30]认为通过ITS区域比对，序列相似性大于99%，鉴别为相同种；序列相似性大于95%且小于99%，鉴别为相同属；序列相似性小于95%，鉴别为相同科。

2 结果与分析

2.1 形态鉴定

采于玉龙县鲁甸乡的滇黄精分离培养得到15皿寄生真菌菌落，采于华坪县的滇黄精分离得到22皿寄生真菌菌落。同时，对两地滇黄精寄生真菌菌落进行观察和具体形态特征的统计分析（图1～2、表1～2）。

表1 玉龙县鲁甸乡黄精寄生真菌菌落统计及具体形态特征

表2 华坪县黄精寄生真菌菌落统计及具体形态特征

图1 玉龙县鲁甸乡滇黄精寄生真菌菌落形态

图2 华坪县滇黄精寄生真菌菌落形态图

2.2 分子生物学鉴定结果

序列比对结果显示，玉龙县鲁甸乡15株寄生真菌菌落中包括1株青霉属、12株尖孢镰刀菌、1株木贼镰刀菌、1株链格孢菌，镰刀菌（木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌）占总菌落的86.66%，可初步认定其为优势寄生种。华坪县22株滇黄精寄生真菌菌落中包括12株黑绿木霉、9株芬芳镰刀菌、1株木贼镰刀菌，黑绿木霉占总菌落的54.5%，可初步认定其为优势寄生种（表3～4）。

表3 玉龙县鲁甸乡滇黄精寄生真菌DNA序列与NCBI数据库比对结果

表4 华坪县滇黄精寄生真菌DNA序列与NCBI数据库比对结果

3 讨论

由丽江华坪县和玉龙县鲁甸乡两地滇黄精寄生真菌分离与鉴定结果可知，镰刀菌属真菌是滇黄精主要的致病真菌，其次是木霉属真菌，试验中木霉菌属只发生于华坪县滇黄精中。镰刀菌属拥有多种致病菌，具有致病范围广和治病能力强等特点，可引起植物的萎蔫、穗腐和根腐等多种病症，如小麦赤霉病、香蕉枯萎病和棉花枯萎病，已成为世界上重要的致病真菌之一[30]。因此两地在进行滇黄精种植病害防治时，应以镰刀菌属真菌为主要防治对象，合理采取防治措施。

滇黄精作为药食两用的传统中药资源，具有较大的市场需求。已有文献中关于滇黄精病害的研究报道较少，其中王桥美等[14]认为滇黄精主要病害有叶斑病、黑斑病、炭疽病，叶斑病和黑斑病的致病真菌主要为链格孢属(Alternaria)。杨林毅[31]对采于云南曲靖的滇黄精进行病原真菌的分离鉴定，得到主要致病真菌为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。笔者从丽江滇黄精中分离鉴定得到镰刀菌属真菌，其中采于玉龙县鲁甸乡的滇黄精还分离得到链格孢属真菌，与2篇报道有共性之处。但镰刀菌属真菌是滇黄精普遍的致病真菌仍需要进一步研究。各地在滇黄精病害防治时，应该因地制宜，采取科学有效的方法进行病害防治。