一株纤维素降解菌的筛选与鉴定

杨 娜，何 鑫，杜春梅

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080；3河北环境工程学院/河北省农业生态安全重点实验室，河北秦皇岛 066102）

0 引言

玉米秸秆是一种可再生能源，全国玉米秸秆年产量约2.64亿t[1]，其中被有效加工利用的秸秆仅有不到20%。在全球范围内，玉米秸秆主要通过燃烧的方式处理，造成了极大的浪费而且污染环境。虽然可以用物理和化学方法来有效水解复杂的纤维素聚合物，但物理化学处理通常需要苛刻和极端的条件[2-3]。利用微生物降解秸秆具有效率高、对环境无害且反应温和的优势，已经成为秸秆降解研究的热点，具有广泛的应用前景。分离和筛选高效纤维素降解菌能为制备高效微生物腐熟剂奠定基础，利用微生物腐熟剂处理玉米秸秆，对推进生态农业的发展具有重要的科学意义。

纤维素是一种含有β-1,4-糖苷键的线性大分子多糖[4-5]，是秸秆细胞壁组成的主要成分，玉米秸秆的纤维素含量高达38%～50%[6]。此外，秸秆中的木质素和半纤维素的存在使得秸秆降解率较低。纤维素可以被纤维素酶完全水解为葡萄糖，首先内切葡聚糖酶沿纤维素链随机水解β-1,4-糖苷键，之后外切葡聚糖酶作用于纤维素链的还原端或非还原端，对β-1,4-糖苷键进行水解产生纤维二糖，最终β-葡聚糖苷酶将纤维二糖和水溶性纤维糊精水解成葡萄糖[7-8]，这3种酶是由细菌、放线菌和真菌等微生物自然产生的[9-10]。微生物可以产生大量的纤维素酶降解秸秆中的纤维素，解决秸秆腐熟速度慢的问题。目前，纤维素降解菌及其产生的酶因其具有经济潜力大、对生态环境友好而备受关注。前人研究发现产生纤维素酶的微生物主要包括真菌、细菌和放线菌，真菌主要分布在木霉属、青霉属、曲霉属和毛壳菌属[11-12]，细菌主要分布在芽孢杆菌属、拟杆菌属和梭菌属[13-15]，放线菌主要分布在链霉菌属[16-17]。然而，尽管已经发现了较多的微生物可用于秸秆腐熟，但是能在生产中应用的并不多，其中很多菌株是从牛粪中分离得到，在粪肥存在的情况下，才能发挥其效力。目前国内氨基酸工业化生产过程中会产生大量的尾液，这些尾液富含大量的蛋白和氨氮类物质，处理难度较大，成本较高[18]，如果能将这些尾液应用于有机肥生产，不但解决了氨氮和秸秆对环境的污染问题，还能产生巨大的经济效益，有助于推进生态农业的发展。本研究以氨基酸尾液为氮源，对自然堆腐条件不同时期的玉米秸秆进行取样，筛选高效降解纤维素的菌株并进行鉴定，获得了能够快速降解玉米秸秆的菌株，为制备高效玉米秸秆腐熟剂，利用氨基酸尾液和玉米秸秆制备有机肥料奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 样品采集于自然堆腐发酵各阶段，4℃冷藏备用。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基、种子培养基、玉米秸秆段液体发酵培养基、固体产酶培养基，均参照文献配制[19-22]。

1.2 菌株的分离纯化

取10 g不同时期堆腐中的秸秆，加入到装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，180 r/min摇床培养30 min，静止20 min，取1 mL进行梯度稀释，得到浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌液，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基及PDA培养基上，每个梯度做3个平板，30℃倒置培养，直至菌落长出，挑选不同菌株分离纯化，获得纯种菌株。

1.3 菌株的初筛

采用点接种法分别将菌株接种至羧甲基纤维素钠平板上，每个平板接3个点，30℃培养3天后，用1 mg/mL的刚果红染液染色30 min，弃去染液，加入1 mol/L的NaCl溶液脱色20 min。降解纤维素的能力以水解圈与菌落直径比值大小为指标，记录水解圈和菌落直径。

1.4 菌株的复筛

1.4.1 纤维素相关酶活性测定 粗酶液的制备：按体积比为15%的接种量将培养物接种于固体产酶培养基中，30℃培养4天，10 g固体产酶培养基加100 mL水，37℃，100 r/min气浴振荡提取1 h，发酵液经无菌纱布过滤后在8000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。

酶活力测定：滤纸酶活、内切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力、β-葡聚糖苷酶活力，参照许玉林等[23]的方法进行测定。

1.4.2 玉米秸秆降解率测定 将菌株接种至种子培养基，之后按5%的比例接种至玉米秸秆段液体发酵培养基中，以接种等量无菌水为空白对照，在30℃、180 r/min条件下液体发酵10天。液体发酵降解结束后，5000 r/min离心10 min，弃上清，得到的玉米秸秆降解剩余物用无菌蒸馏水反复清洗3次，80℃烘干至恒重，称重，计算降解率，公式见(1)。

式中，m1为发酵前烘干至恒重的秸秆重量，g；m2为发酵后烘干至恒重的残余秸秆的重量，g。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 形态学鉴定 将待鉴定的菌株接种在PDA平板上，28℃恒温培养5天，观察菌落形态和颜色，在光学显微镜下观察孢子、产孢体、菌丝的形态结构。参考《真菌鉴定手册》进行分类鉴定。

1.5.2 分子生物学鉴定 使用真菌基因DNA提取试剂盒（索莱宝）进行DNA提取后，利用曲霉的特异引物[β-tubulin(Ben A)Bt2a 5'-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3'、Bt2b 5'-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3']扩增，产物由擎科生物测序，将ITS区片段的测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，并采用Mega软件分析并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离与初筛

将从玉米秸秆样品中分离纯化得到的菌株，通过羧甲基纤维素钠培养基经刚果红染色后得到6株具有纤维素降解能力的菌株。其中ND19透明圈最大，D/d值为 2.83（表 1）。

表1 刚果红染色试验结果

2.2 纤维素降解菌的复筛

2.2.1 纤维素酶活力测定 由图1可知，不同菌株的同一种酶活力大小不同，相同菌株的4种酶活差别也很大。6株菌中滤纸酶活最大的为SC2，酶活为17.7 U/mL，SC4的内切葡聚糖酶活力最大，为58.97 U/mL，SC4的外切葡聚糖酶活力最大，为16.85 U/mL，但与SC2的差异不显著，β-葡聚糖苷酶活最高的为SC2，显著高于其他5株菌，达到79.26 U/mL。

图1 不同菌株4种纤维素酶的活力

2.2.2 玉米秸秆降解率测定 如图2所示，6株菌均对玉米秸秆均有一定的降解作用，其中SC2对玉米秸秆的降解效果最好，降解率达到33.07%，SC4的降解效果次之，玉米秸秆的降解率为32.85%。

图2 不同菌株对玉米秸秆的降解率

2.3 菌株SC2的鉴定结果

2.3.1 形态学鉴定结果 在PDA培养基上，SC2最初为白色，之后变成黑褐色厚绒状，产生大量黑褐色孢子（图3A），背面中央略带黄褐色（图3B），显微镜下观察，分生孢子梗细长，顶端分生孢子头呈球形顶囊，上面有大量褐色球形分生孢子，直径3.2 μm-3.9 μm（图3C）。

图3 菌株SC2显微形态及菌落形态

2.3.2 分子生物学鉴定结果 系统发育进化树（图4）显示，菌株SC2与黑曲霉(Aspergillus niger HQ632726.1)的亲缘关系最近，结合其形态特征，将SC2鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。

图4 菌株SC2的系统发育树

3 讨论

3.1 纤维素降解菌的分离筛选

中国玉米秸秆产量大，如果能够进行有效的利用，不仅能提高生物质资源的利用，还可以有效降低环境污染。但是秸秆纤维素有很强的糖苷键，降解困难，因此大部分纤维素不能被有效利用[24]。目前，大部分玉米等农作物秸秆的处理方式仍然是被焚烧，不但造成资源的浪费，而且污染环境[25]。为了合理有效的利用玉米秸秆纤维素，筛选高效降解纤维素的微生物引起了广泛的关注。纤维素降解菌通常是从腐殖土壤、腐烂秸秆、牛粪等进行分离。黄亚丽等[26]从土壤中筛选出一株低温秸秆降解菌长枝木霉，使用沙袋法测定15天、30天、45天的玉米秸秆降解率，结果表明45天时玉米秸秆降解率达到56.73%。刘晓飞等[17]从寒地黑土中分离到一株链霉菌，滤纸酶活为11.94 U/mL，培养5天时，对玉米秸秆降解率达到23.54%，其中纤维素降解率为30.33%。Sun等[27]对地衣芽孢杆菌进行了产羧甲基纤维素酶和滤纸酶条件优化，优化后对纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为35.42%、17.47%和20.19%。张冬雪等[28]在稻田土壤中分离筛选出一株草酸青霉菌，其CMC酶活在第5天时达到最高，为29.35 U/mL，培养15天后对水稻秸秆的降解率达到45.72%。王勇等[29]从堆积枯枝的腐殖土壤中筛选到一株黑曲霉，其滤纸酶活、内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活分别为17.35、8.47、16.35 U/mL。孙美娜等[30]从棉秆表面分离到4株真菌，分别为黑曲霉、赤霉、链格孢霉、青霉菌，10天时黑曲霉对于棉花秸秆的降解率为30.06%。但是，迄今为止未见有从以氨基酸尾液为氮源的自然发酵堆肥中分离秸秆降解菌的报道。本研究从以氨基酸尾液为氮源的自然发酵堆肥中分离到1株黑曲霉SC2，其滤纸酶活为17.70 U/mL，玉米秸秆降解率为33.07%。本研究为提高玉米秸秆的降解率，开发微生物堆肥菌剂或酶制剂奠定了工作基础。

3.2 利用氨基酸尾液降解秸秆

氨基酸尾液的产量很大，每生产1 t纯氨基酸会产生40 t的发酵尾液，培养单细胞酵母蛋白是处理氨基酸尾液最常用的方法，还可以制成复合肥、蛋白饲料等，但成本高、效果也不理想。李思杨[31]以氨基酸尾液为氮源，利用复合菌剂处理水稻秸秆，降解率达到16.08%。这表明可以将氨基酸尾液作为氮源对秸秆进行腐熟，一方面能有效解决氨基酸尾液的治理问题，另一方面氨基酸尾液用于堆肥比尿素成本更低，可以产生更大的经济效益。本研究从以氨基酸尾液为氮源的自然发酵堆肥中分离到1株降解率较高的菌株，为制备更高效的复合菌剂奠定了基础。

3.3 复合菌剂降解秸秆的发展趋势

在自然界中，纤维素的降解过程一般是多种微生物产生的多种酶之间协同作用的结果。而野生型单一菌株很难产生纤维素降解所需要的全部酶，且单一菌株产生的不同酶的活性存在显著差异，导致其降解作用和效果有限。因此，野生型菌株SC2的降解率还有很大的提升空间，可以通过对其进行发酵条件的优化、高效菌株的选育、以及与其他菌株复配等手段，大大提高其作用效率。Gong等[32]从腐殖质中筛选出3株分别对木质素、纤维素、半纤维素高效降解的菌株，并构建了高效降解玉米秸秆的复合菌系，在最佳工艺条件下，该复合菌系降解后的玉米秸秆失重率达60.55%。李静等[33]通过分离筛选菌株后将类芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属进行复配，对玉米秸秆的降解率为31.8%，比构成复合菌系中的单菌株有显著提高。后续，本实验室将利用SC2与其他产纤维素酶菌株组合构建高效的纤维素降解菌系，以期能为高效腐熟玉米秸秆菌剂的研发奠定基础，为促进玉米秸秆堆肥发酵的腐熟过程，提高玉米秸秆资源的利用提供科学依据。

4 结论

本研究从以氨基酸尾液为氮源的自然发酵堆肥中分离筛选得到1株高效纤维素降解菌SC2，其滤纸酶活为17.70 U/mL，玉米秸秆降解率为33.07%，经过形态学及分子生物学鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。