姜黄素通过降低压力超负荷心肌肥厚大鼠循环微颗粒水平改善内皮功能发挥心脏保护作用

崔欣欣，白晓洁，王起越，李俊虎，曹茜倩，林媛媛，封启龙

(1.山西医科大学基础医学院生理学系，细胞生理学教育部重点实验室，细胞生理学山西省重点实验室，山西 太原 030001;2.太原市卫生学校临床教研室，山西 太原 030012;3.山西医科大学第三医院 山西白求恩医院心血管内科，山西 太原 030032)

病理性心肌肥厚是由高血压、心律失常等多种原因引起的心脏组织结构的异常改变，如未给予及时有效的干预将最终发展为不可逆转的心力衰竭[1]。然而，目前对心肌肥厚尚缺乏有效干预措施，许多临床使用的药物也仅限于在一定程度上缓解症状，因此，如何对心肌肥厚进行有效干预，仍是临床亟需解决的热点问题。天然化合物姜黄素(curcumin)对多种心血管疾病如动脉粥样硬化、心律失常、心力衰竭等均表现出显著的心血管保护效应，对心肌肥厚也具有一定的心脏保护作用，但其对循环微颗粒的影响尚未完全阐明[2-5]。近年来，许多研究发现，细胞微颗粒(microparticles，MPs)在多种心血管疾病的发生发展过程中具有重要作用[6]。MPs是细胞受刺激后从细胞表面脱落的直径0.1-1 μm的细胞外囊泡，其内容物所包含的mRNA、蛋白质、微小核糖核酸等物质在细胞间信息传递过程中具有非常重要的作用[7]。MPs在健康人循环血液中就有少量存在，在病理状态下如心肌肥厚、冠状动脉疾病、肿瘤等疾病中含量则明显升高。目前认为，MPs具有促进凝血反应、血栓形成、炎症反应、上调血管张力、促进血管生成等多种作用，并参与了多种疾病的发生发展[8]，但其在心肌肥厚大鼠体内的改变及其确切作用尚不清楚。

本实验利用腹主动脉缩窄术(abdominal aortic constriction，AAC)建立心肌肥厚大鼠模型，用姜黄素干预4周后观察其对大鼠心脏功能的影响，同时检测了各组大鼠循环血液中的微颗粒水平。探讨姜黄素的心脏保护作用是否与微颗粒有关，进一步观察了MPs对体外培养内皮细胞活力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物和细胞株 SPF级健康SD ♂大鼠，体质量为(180-200)g，购于山西医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(晋)2015-0001；人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2试剂 姜黄素购自上海易恩化学技术有限公司；DMEM低糖细胞培养基购于Hyclone公司；BCA蛋白质定量试剂盒、CCK-8试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购自CellMax公司。

1.1.3器械 台式低速离心机(SC-3612)购自安徽中佳科学仪器有限公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司；超级恒温水浴箱、BL-420F生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司；M模式超声系统(Vivid 7)购于美国GE Healthcare公司；酶标仪(SMP6)购自美国Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1模型制备及动物分组 采用腹主动脉缩窄术建立压力超负荷心肌肥厚大鼠模型。大鼠麻醉备皮后，沿腹正中线切开皮肤，钝性分离皮下肌层，在肾动脉分叉处上方约1 cm游离腹主动脉，用4-0结扎线同时结扎垫扎针和腹主动脉，抽出垫扎针，抗菌处理后关闭腹腔。Sham组大鼠(n=10),只穿线不结扎，其余步骤相同。16周后超声心动图评价手术大鼠心功能，达到心肌肥厚标准的大鼠随机分为AAC组(n=10，每日给予等量生理盐水灌胃处理，持续4周)；姜黄素组(n=10，每日按100 mg·kg-1剂量给予姜黄素灌胃，持续四周)。每组10只大鼠中随机抽取6只进行超声和血压检测，4只用于左心室血流动力学检测。动物发生死亡则补足至10只。

1.2.2超声心动图检测心功能 10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，待肌肉松弛后行心前区备皮进行超声心动图检测。观察指标包括左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)以及左室后壁厚度(LVPWd)。

1.2.3心率及血流动力学检测 25%乌拉坦(4 mL·kg-1)麻醉大鼠，将其仰卧位固定于手术台上，四肢连接上心电图导联线记录心率(HR)变化；颈部备皮后沿颈正中线切开皮肤，钝性分离皮下肌层，暴露右颈总动脉，穿线结扎远心端，动脉夹夹闭近心端，穿线备用，使用眼科剪在右颈总动脉中上1/3处剪一小口，插入充满含肝素生理盐水的动脉插管，固定并结扎，待出现血压波稳定10 min后记录大鼠平均动脉压(MAP);缓缓推动插管至左心室，记录以下血流动力学指标：左心室舒张末期压力(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室内压力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.4血浆样本制备及提取微颗粒 参考文献[9]，从左侧颈总动脉收集血液于含3.8%枸橼酸钠采血管中，1 550×g离心20 min取上层乏血小板血浆(platelet-free plasma，PFP)，将PFP 15 000×g再离心45 min,弃上清，PBS液吹打沉淀得MPs悬液，-80 ℃保存备用。

1.2.5循环MPs蛋白含量检测 严格按照BCA试剂盒说明配制标准品与工作液，取各组MPs加入工作液，每个样品设置6个复孔，37 ℃孵育30 min，酶标仪检测吸光度，按标准曲线计算蛋白浓度。

1.2.6循环MPs对内皮细胞存活率的影响 取人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，以2.5×104的密度铺96孔板，贴壁后将Sham组、AAC组和姜黄素组微颗粒以100 m g·L-1的浓度加入培养基，Control组加入等量PBS，孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，1 h后，酶标仪检测吸光度，按公式计算存活率。

2 结果

2.1 一般状况和存活率实验周期内，与Sham组相比，AAC组大鼠毛发干燥发黄、饮食、饮水量及活动度下降，姜黄素组大鼠的上述表现明显改善。Sham组与姜黄素组大鼠无死亡，存活率为100%，AAC组大鼠在给药开始后d 6和d 25各死亡1只，存活率为80%(Fig 1)。

2.2 超声心动图心功能测定与Sham组相比，AAC组LVIDd从(5.05±0.24)mm升高到(7.44±0.52)mm(P<0.01)，LVIDs从(2.01±0.22)mm升高到(4.02±0.47)mm(P<0.01)、LVPWd从(2.17±0.10)mm升高到(2.66±0.16)mm(P<0.05)，EF从93.00%±1.35%下降至80.00%±4.49%(P<0.05)、FS从60.50%±2.53%下降至46.38%±4.90%(P<0.05)，表明造模成功。使用姜黄素(图中简称Cur)后，上述指标均有明显改善，其中LVIDd、LVIDs和LVPWd分别下降至(6.09±0.22)mm(P<0.05)、(2.38±0.17)mm(P<0.01)、(2.20±0.10)mm(P<0.05)；EF以及FS分别升高至92.88%±0.95%(P<0.01)，61%±1.80%(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1 Kaplan-Meier survival curves for rats with pressure overload-induced hypertrophy

2.3 动脉压与心率术后20周，与Sham组相比，AAC组大鼠MAP较Sham组升高明显(139.84±6.76)vs(88.89±12.42)mmHg，(P<0.01)，姜黄素治疗后，MAP明显降低(117.08±5.57)mmHg，(P<0.05)(Fig 3B、C)。AAC组大鼠HR增加(401±26vs233±8)，(P<0.01)，如Fig 3A所示，使用姜黄素后，心率有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)(Fig 3D)。

Fig 2 Assessment of global cardiac function using echocardiography in rats with pressure overload-induced hypertrophy 4 wks after treatment

Fig 3 Measurement of heart rate and blood pressure in rats with pressure-overload hypertrophy

Fig 4 Results of hemodynamics after treatment in rats with pressure overload-induced hypertrophy

2.4 血流动力学指标术后20周，AAC组大鼠LVSP较Sham组显著下降(100.22±8.95vs159.51±2.56 mmHg，P<0.01)，+dp/dtmax(4.11±0.46vs8.40±0.31 mmHg/ms)和-dp/dtmax(3.39±0.37vs6.95±0.47 mmHg/ms)均明显下降(P<0.01)，LVEDP明显升高(4.55±1.05vs-11.63±1.90 mmHg，P<0.05)，心脏收缩和舒张功能出现障碍。姜黄素组大鼠的上述指标LVSP(142.02±5.30 mmHg，P<0.01)、LVEDP(-5.34±1.65 mmHg，P<0.05)、+dp/dtmax(6.56±0.63 mmHg/ms，P<0.01)以及-dp/dtmax(5.12±0.56 mmHg/ms，P<0.05)均得到明显改善(Fig 4A-D)。

2.5 循环MPs蛋白含量测定利用BCA试剂盒进行循环血MPs蛋白含量测定。结果显示，AAC组大鼠血液中混合微颗粒蛋白含量较Sham组明显升高(371.43±5.62)vs(120.8±3.44)mg·L-1(P<0.01)，姜黄素干预后，微颗粒蛋白含量明显降低(245.05±3.80)mg·L-1(P<0.01)(Fig 5)。

2.6 微颗粒对内皮细胞存活能力的影响将对照组的HUVEC存活率设为100%，细胞存活率的统计结果表明，与Sham组大鼠循环血MPs共孵育的HUVEC存活率为(98.88%±4.30%)，AAC组存活率明显下降(80.18%±6.17%，P<0.05)，姜黄素组微颗粒共孵育的HUVEC的存活率明显升高(93.61%±2.26%，P<0.05)(Fig 6)。

Fig 5 Results of different groups of protein concentration

Fig 6 Cell survival rate of HUVECs treated with rat circulating microparticles

3 讨论

循环微颗粒与多种心血管等疾病的发生发展均具有密切关系。一方面，在冠状动脉疾病、心力衰竭、高血压、心律失常、动脉粥样硬化、高血脂等多种疾病或病理情况下，均发现有血中微颗粒的明显升高[10]，提示含量改变有可能作为临床凝血异常、炎症状态和血管功能障碍的疾病标志物[11-12]。Mallat等[13]也报道有冠心病家族史健康个体的内皮MPs水平明显高于无冠心病家族史的健康个体，急性冠脉综合征患者的循环血液中存在高含量的促凝性内皮MPs，可能是冠状动脉内血栓产生和存在的重要因素之一。另一方面，升高的MPs也主动参与了多种疾病的发生和发展进程[14-15]，且其升高程度往往与疾病严重程度呈正相关[16]。

前期本实验室发现，大鼠心力衰竭后微颗粒水平明显升高，且对内皮细胞迁移具有明显抑制作用[17]。众所周知，内皮细胞作为血管系统的重要成分，其功能的改变与心血管疾病的发生发展密切相关[18]。本实验我们发现，心肌肥厚大鼠血液中微颗粒水平亦表现为明显升高。那么，升高的微颗粒是否与心肌肥厚有关？通过体外实验研究发现，MPs与HUVEC共孵育后，可明显降低内皮细胞的存活率，提示MPs直接参与了血管内皮的损伤。

姜黄素是从姜黄中提取的一种黄色多酚类化合物，近年来，多项研究表明姜黄素具有显著的心脏保护作用[2-5]。本研究利用缩窄腹主动脉建立大鼠慢性心肌肥厚模型，观察了姜黄素对慢性心肌肥厚的影响。结果显示，姜黄素可以明显提高模型大鼠存活率，降低MAP，改善LVIDs、LVIDd和LVPWd，提高EF与FS，同时使LVSP升高、LVEDP降低，证实姜黄素具有明显的心脏保护作用。进一步的研究发现，经姜黄素干预后，肥厚大鼠循环MPs水平明显下降，且可显著提高体外实验中HUVEC的存活率。

综上所述，姜黄素对压力超负荷型心肌肥厚具有显著的心脏保护效应，这一作用与姜黄素有效降低循环血中MPs水平，提高内皮存活率有关。关于MPs确切的有效成分，尚有待进一步的实验研究证实。