miR-17通过靶向胰岛素样生长因子1调节冠状动脉疾病中血管平滑肌细胞增殖

金爱萍，李书琳，张倩榕，李 冰

(西安交通大学第二附属医院老年心血管科，陕西西安 710004)

冠状动脉疾病(coronary artery disease, CAD)发病率和死亡率连年攀升。据统计，CAD死亡率由1951年的12.8%上升至2015年44.6%[1]。CAD主要由冠状动脉壁的动脉粥样硬化而引起[2]，而血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)异常增殖可促进动脉粥样硬化斑块的形成，加剧疾病的发生和发展[3]。全面了解VSMCs的增殖在动脉粥样硬化斑块形成中的作用，对预防和治疗CAD具有重要意义。

微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达[4]。miRNA的表达失调可影响心血管疾病的发生和发展[5]。有报道miR-214在血管损伤和心力衰竭中介导血管生成[6]。miR-133a释放入冠状动脉循环可能是CAD进展和并发症的病理机制[7]。同时，在CAD患者的血清中，miR-574-5p表达显着增加，被认为是诊断CAD的生物标志物[8]。

miR-17通过靶向染色质修饰蛋白1A(chromatin modifying protein 1A, CHMP1A)调节视网膜祖细胞的增殖和分化，为视网膜变性疾病的治疗提供了理论依据[9]。miR-17通过靶向胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors-1, IGF-1)调节冠心病中内皮细胞的增殖和凋亡[10]。上调的miR-17通过靶向RND3肿瘤抑制基因而促进细胞增殖，调控肿瘤生长和细胞周期进程[11]。然而，miR-17在CAD患者中的生物学功能和分子机制以及对VSMCs的调控机制还并不清楚。本研究旨在探讨miR-17在VSMCs增殖中的作用及其相关机制，以期为CAD预防和治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 血清样本分别选取2018年1月至2019年1月西安交通大学第二附属医院收治CAD患者的血液样本共32份(n=32)，收集正常的健康者血液样本30份(n=30)。从各参与者中抽取5 mL外周血，在2 h内进行血清提取处理，并于-80 ℃长期保存。在收集样本前，所有参与者均提供了书面知情同意书。

1.2 细胞培养及细胞转染VSMCs和人支气管上皮细胞16HB来源于四川大学华西医院(四川，中国)。使用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)培养细胞，该培养基中添加了100 mL/L FBS和1%青霉素-链霉素溶液(索莱宝，北京，中国)，并在37 ℃ 50 mL/L CO2的培养箱中培养。miR-17模拟物和带有随机序列的阴性对照(NC)从上海基因制药有限公司(上海，中国)获得。质粒pcDNA-IGF-1由上海基因药业有限公司(上海，中国)合成。使用LipofectamineTM3000转染试剂(Invitrogen, 沃尔瑟姆，美国)，按照说明书将所有质粒转染VSMCs，转染24 h，用于后续实验。

1.3 RT-qPCR测定miR-17和IGF-1的mRNA表达用Trizol试剂(Invitrogen, CA，美国)分别自CAD患者血清和VSMCs中提取总RNA。使用M-MLV逆转录酶(RNase H)试剂盒(GeneCopoeia，Rockville，美国)合成cDNA。反应条件：引物与RNA模板先于65 ℃处理5 min再置于冰上，然后加入逆转反应缓冲液及dNTPs，42 ℃孵育60 min，再70 ℃、5 min终止反应。qRT-PCR的20 μL反应体系：1 μL逆转录cDNA(终质量浓度5 ng/μL)、12.5 μL 2×SYBR Green I MasterMix及0.5 μmol/L特异性正向引物、0.5 μmol/L反向引物各1 μL；反应条件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共40个循环。相关引物序列见表1。分别选择U6和GAPDH作为归一化对照，使用2-△△Ct方法计算miR-17和IGF-1的相对表达。所有实验设3组重复。

表1 miR-17与IGF-1和相关内参基因的引物序列

1.4 CCK-8测定VSMCs和人支气管上皮细胞16HB的细胞增殖按照CCK-8试剂盒(Beyotime，南京，中国)使用说明书操作。将VSMCs和人支气管上皮细胞16HB细胞(对照，NC)在96孔板中培养。第3天开始，每孔中将10 μL CCK-8溶液添加到培养基中继续孵育2 h，吸取各孔相应培养液，转移至新的96孔板中，荧光酶标仪用于检测450 nm处的吸光度，观察细胞增殖能力。

1.5 克隆形成测定细胞增殖分别将用miR-17模拟物或pcDNA-IGF-1转染的VSMCs细胞悬液(500个细胞/孔)接种到6孔板中继续培养，每隔3 d更换培养液并观察细胞计数，当大多数克隆中细胞数超过50个时，取出6孔板，弃上清、洗涤、甲醛固定，然后用结晶紫染色后进行克隆计数。

1.6 生物信息学和荧光素酶报告基因检测TargetScan和RNAhybrid用于预测靶基因。参照文献方法[12]进行双重荧光素酶报告基因检测。将野生型或突变型IGF-1扩增到psi-CHECK2报道载体(Promega，威斯康星州，美国)中。将总共2×105个VSMCs接种到12孔板中，随后使用LipofectamineTM3000(Invitrogen，沃尔瑟姆，美国)与野生型或突变型质粒IGF-1 3′-UTR载体和miR-17模拟物或NC模拟物共转染。在37 ℃下放置48 h。根据制造商的说明，采用双重荧光素酶报告基因分析系统(Promega，麦迪逊，威斯康星州，美国)检测VSMCs的荧光素酶活性。

1.7 统计学分析所有实验至少重复3次，数据以均数±标准差表示，使用GraphPad Prism 6(San Diego, CA)进行统计学分析。组间差异使用t检验或单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-17在CAD中上调RT-qPCR结果显示，与对照组相比，CAD患者血清和VSMCs中miR-17的表达均显著上调(P<0.01，图1)。这表明CAD患者的血清和细胞中的miR-17表达上调。

图1 RT-qPCR检测CAD患者血清(A)和培养VSMCs中(B)miR-17的mRNA表达

2.2 miR-17的过表达促进VSMCs增殖miR-17模拟物转染到VSMCs中，成功过表达(P<0.01)；通过CCK-8和克隆形成实验检测VSMCs增殖的结果显示，与对照组相比，miR-17过表达组VSMCs细胞增殖和克隆形成数均显著升高(P<0.05，图2)。这表明miR-17的过表达促进VSMCs增殖。

图2 miR-17的过表达促进VSMCs增殖

2.3 miR-17的低表达抑制VSMCs增殖miR-17抑制物转染的VSMCs中miR-17呈现低表达(P<0.05)；CCK-8和克隆形成检测VSMCs增殖的结果显示，与对照组相比，miR-17低表达组VSMCs细胞增殖和克隆形成数均显著降低(P<0.01，图3)。这表明miR-17低表达可抑制VSMCs增殖。

图3 miR-17表达下调抑制VSMCs增殖

2.4 miR-17靶向调控IGF-1应用生物信息学分析预测的结果表明，在IGF-1的3′-UTR中观察到miR-17的结合位点(图4A)。同时，荧光素酶报告基因测定结果显示，与野生型IGF-1质粒和miR-17模拟物共转染的VSMCs的荧光素酶活性升高(P<0.01)，而转染突变型IGF-1质粒和miR-17模拟物的VSMCs的荧光素酶活性无改变(图4B)。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，在miR-17过表达的VSMCs中IGF-1表达上调(P<0.01，图4C)。这表明，IGF-1是miR-17的靶标基因，且受其正向调控。

图4 miR-17靶向调控IGF-1

2.5 miR-17通过IGF-1促进VSMCs增殖用Lipofectamine 2000转染重组质粒pcDNA3.1-IGF-1并成功过表达IGF-1；CCK-8和克隆形成测定的结果显示，与对照组相比，IGF-1过表达组VSMCs细胞增殖和克隆形成数均显著升高(P<0.05，图5)。这表明，miR-17通过IGF-1促进VSMCs增殖。

图5 miR-17通过IGF-1调控VSMCs增殖

3 讨 论

CAD主要由动脉粥样硬化斑块形成所引起，是血栓形成或急性冠状动脉疾病的结果。miRNA可能参与了动脉粥样硬化的发生发展，并作为重要的潜在生理检测指标[13]。而VSMCs异常增殖可促进动脉粥样硬化斑块的形成，加剧疾病的发生和发展[14]。

miRNA是短链非编码RNA分子，通过与靶基因的3′-UTR结合在转录或翻译水平调节基因表达。miR-17家族又称为miR-106b家族，其结构相近，种子序列相同(AAAGUGCU)[15-16]。近年来已在不同病理模型中证实，miR-17不但参与动物心、肺、免疫系统等器官发育，并在肿瘤发生过程中发挥着重要作用[17-18]。已有研究报道，CAD患者miR133a、208b、126、197、223和122-5p的高水平与高死亡率紧密关联[19-23]。调节其表达可能是抑制VSMCs增殖的有效方法，从而改善血管内皮细胞的再生、血管损伤和减轻病理性心脏肥大[24]。例如，在冠心病中，miR-17通过靶向IGF-1调节内皮细胞的增殖和凋亡[10]。本研究发现，miR-17在CAD患者血清和VSMCs中均上调；miR-17的过表达促进VSMCs增殖，而miR-17的低表达抑制VSMCs增殖，表明miR-17可以作为CAD的预测生物标志物。这提示miR-17促进CAD的病程发展，可能是一个重要的预防和治疗的靶标。

IGF-1是一种肽激素，在促进细胞增殖和生长以及抑制炎症中起着至关重要的作用[25]。然而，IGF-1的抗炎和修复功能会导致动脉粥样硬化，IGF-1的部分缺乏则导致收缩力和血管紧张素Ⅱ敏感性降低，并改变了涉及心脏结构和功能相关基因的表达，促使心血管内皮细胞凋亡[26-27]。本研究结果显示，IGF-1是miR-17的潜在靶标，受miR-17的正向调控，IGF-1的过表达促进诱导VSMCs的增殖。IGF-1可能参与CAD进展的调控，可作为潜在的治疗靶标。

综上所述，本研究表明，miR-17在CAD患者血清和VSMCs中表达上调；miR-17的过表达促进VSMCs增殖，而miR-17的低表达抑制VSMCs增殖；IGF-1是miR-17的靶标，并受其正向调控；miR-17通过IGF-1促进VSMCs增殖。miR-17可以作为CAD预测和治疗的生物标志物，IGF-1可能是潜在的治疗靶点。