GAB1在ER阳性乳腺癌组织中的表达及其对MCF-7细胞转移能力的影响

张世民，董洪梅，赵瑞君

(1. 彭泽县人民医院普外科，江西彭泽 332700；2. 暨南大学医学院暨南大学基础医学与公共卫生学院肿瘤精准医学和病理研究所，广东广州 510632；3. 南昌市第三医院乳腺疾病诊疗中心，江西南昌 330009)

最新全球癌症统计数据显示，乳腺癌仍然高居女性恶性肿瘤发病率第一位，其每年新增病例226万例，死亡人数68万，其中雌激素受体(ER)阳性乳腺癌约占全部乳腺癌的70%[1]。目前，针对ER阳性乳腺癌的主要治疗策略是内分泌治疗，这种治疗方式已经在一定程度上延长了乳腺癌患者的生存时间，但仍有一些患者在接受治疗的过程中产生耐药，从而影响后续的治疗[2-3]。发生耐药的患者，其癌细胞侵袭性更强，更容易发生远处转移，从而导致患者预后不良[3]。因此，寻找与ER阳性乳腺癌转移及预后相关的分子标志物，对ER阳性乳腺癌的诊断、治疗具有十分重要的指导意义。

GAB1蛋白(Grb2-associated binding protein 1)是一类能与生长因子受体结合蛋白2(GAB2)相结合的适配蛋白。GAB1蛋白在哺乳动物的细胞质中广泛表达，激活后能参与不同信号转导通路，特别是可以通过激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)及磷酸肌苷3-激酶(PI3K/Akt)信号通路，进而促进细胞增殖、分化和转移[4]。目前，已有多项研究表明，GAB1与肝癌、胶质瘤、非小细胞肺癌和口腔鳞状细胞癌等多种肿瘤密切相关[5]，但GAB1在ER阳性乳腺癌中的表达、预后以及对肿瘤细胞的侵袭、迁移过程中上皮间质转化意义却未见报道。本研究通过免疫组化方法分析GAB1在乳腺癌组织中的表达情况，通过Transwell实验检测干扰GAB1基因后对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响， Western blotting法检测干扰GAB1后EMT因子的表达，多因素COX比例风险模型分析GAB1与ER阳性乳腺癌患者预后的关系，旨在揭示GAB1在ER阳性乳腺癌发生发展和转移中的作用，为ER阳性乳腺癌患者的治疗和预后提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集南昌市第三医院2003年7月至2012年1月间收治的资料完整的171例ER阳性乳腺癌。所有患者均行手术治疗，术前均未行新辅助化疗、放疗或内分泌治疗。所有患者均为女性，年龄25～76岁，中位年龄50岁。肿瘤直径≤2 cm的患者103例，>2 cm的患者68例；有腋窝淋巴结转移的患者56例，无腋窝淋巴结转移的患者115例；肿瘤组织学分级为Ⅰ级的患者57例，Ⅱ级的患者72例，Ⅲ级的患者42例；根据美国癌症联合会(AJCC)乳腺癌分期第6版分期标准，Ⅰ期和Ⅱ期的患者105例，Ⅲ期的患者66例。患者中位随访时间为99个月(6～148个月)。本研究所有患者都签署了知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 免疫组织化学检测免疫组织化学染色采用SP二步法。兔抗人GAB1多克隆抗体购自Abcam公司，SP试剂盒购自福州迈新公司。将手术切除的乳腺肿瘤组织，经4%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚切片，脱蜡水化，微波抗原修复，PBS冲洗，30 mL/L H2O2阻断内源性过氧化氢酶，血清封闭，一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 免疫组化的结果判定由两名病理学专家在临床和病理资料双盲条件下对免疫组化的染色结果进行评分。GAB1蛋白细胞质染色为阳性染色。毎例组织选取10个高倍镜(×400)视野，按照阳性肿瘤细胞占总细胞的百分比及细胞染色强度进行评判：①按阳性细胞百分比进行评分：无阳性染色细胞为0分，≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。②按细胞染色强度进行评分：弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。将两者得分相乘得到总分数：即0～12分。根据约登指数最大原则将评分≥4的患者定义为GAB1高表达组，评分<4定义为GAB1低表达组。

1.4 细胞培养ER阳性的乳腺癌细胞MCF-7购自ATCC细胞库。常规培养于含100 mL/L FBS的高糖DMEM培养基，置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。

1.5 细胞转染将对数生长期的MCF-7细胞接种于6孔板，当细胞融合率达70%～80%时可以进行转染。取MCF-7/shGAB1, MCF-7/shRNA-control质粒，分别与新鲜无血清DMEM培养液混合。室温静置20 min，将混合液滴加至相应孔中，放于50 mL/L CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养。转染24 h后，PBS漂洗，消化细胞，加400 μg/mL G418(美国Gibco公司)筛选细胞，10 d左右后形成阳性抗性克隆，经蛋白水平鉴定，确认获得稳定干扰GAB1基因的细胞。

1.6 Western blotting检测GAB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表达提取MCF-7细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳，后将蛋白转移至PVDF膜上，用含50 g/L奶粉封闭液室温封闭1 h，分别使用anti-GAB1(1∶1 000)、anti-E-cadherin(1∶1 000)和anti-Vimentin(1∶2 000)抗体4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h，TBST液洗膜3次，每次洗10 min，ECL发光试剂盒显影曝光。

1.7 干扰GAB1对MCF-7细胞迁移和侵袭能力的影响将MCF-7-shGAB1，MCF-7/shRNA-control细胞按1×105/孔的细胞密度接种到人工基底膜上。侵袭实验中，碳酸酯膜(PVPF膜，孔径8 μm)上包被1 mg/mL的Matrigel胶，37 ℃放置30 min。下室加入500 μL含100 mL/L FBS的DMEM培养液，在上室中分别加入上述2组含无血清培养基的单细胞悬液，37 ℃孵育24 h后，1 mL甲醇固定15 min，结晶紫染液染色5 min，用乙醇棉球小心擦掉上室没侵袭到下室的细胞。正置显微镜下选取5个200×视野，计算平均值，比较细胞相对侵袭和迁移能力。细胞迁移实验除上层小室不加Matrigel基质胶外，培养、染色、计数方法同侵袭实验。

1.8 统计学分析所有数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析。2组样本均数的比较采用Student’st检验。使用χ2检验分析GAB1蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系。采用Kaplan-Meier曲线法进行无复发生存分析，显著性比较采用Log-rank检验，使用单因素和多因素Cox比例风险模型分析GAB1和临床参数对患者预后的影响。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 GAB1在ER阳性乳腺癌组织中的表达免疫组化结果显示，在171例ER阳性乳腺癌组织中，93例(54.4%)为GAB1高表达，78例(45.6%)为GAB1低表达。GAB1主要阳性表达部位为肿瘤细胞的细胞质(图1)。

图1 GAB1在ER阳性乳腺癌组织中的表达情况

2.2 GAB1表达与ER阳性乳腺癌临床病理学特征的关系通过χ2检验分析GAB1蛋白表达与ER阳性乳腺癌患者临床病理学特征的关系，发现有腋窝淋巴结转移组的GAB1高表达率明显高于无腋窝淋巴结转移组患者(P=0.014)；肿瘤分期为Ⅲ期组的GAB1高表达率明显高于肿瘤分期为Ⅰ+Ⅱ期组患者(P=0.011)，GAB1表达与患者年龄、肿瘤直径和肿瘤的组织学分级无关(表1)。

表1 GAB1表达与ER阳性乳腺癌临床病理学特征的关系

2.3 稳定干扰GAB1基因细胞系的成功构建Western blotting结果显示，与对照组比较，干扰GAB1的MCF-7细胞组中GAB1的蛋白表达明显降低，证明本研究成功建立了稳定干扰GAB1基因的细胞系(图2)。

图2 Western blotting检测干扰GAB1及对照组细胞中GAB1蛋白的表达

2.4 干扰GAB1对MCF-7细胞的迁移侵袭能力的影响通过Transwell侵袭迁移实验评估GAB1对MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响。细胞迁移实验显示，与对照组相比，迁移到下室的shGAB1组细胞数目明显减少(P<0.001，图3)。侵袭实验结果也显示，与对照组相比，侵袭到下室的shGAB1组细胞数目也明显减少(P=0.002，图3)。

图3 干扰GAB1对MCF-7细胞迁移侵袭能力的影响

2.5 干扰GAB1对EMT相关因子的影响与对照组比较，干扰GAB1表达后，E-cadherin的表达水平明显增高，而Vimentin的表达明显降低(图4)。

图4 Western blotting检测干扰GAB1后E-cadherin和Vimentin蛋白的表达

2.6 GAB1表达与ER阳性乳腺癌患者预后的关系使用Kaplan-Meier方法评估GAB1表达对ER阳性乳腺癌患者无复发生存的影响。结果表明，与GAB1低表达组相比，GAB1高表达组患者的无复发生存率更短(P=0.002，log-rank检验，χ2=9.649)(图5)。GAB1高表达组患者的平均无复发生存时间为96.6个月，而GAB1低表达组患者的平均无复发生存时间为119.5个月。

图5 GAB1高表达与ER阳性乳腺癌患者预后不良的相关性

2.7 GAB1表达与ER阳性乳腺癌患者无复发生存的单因素及多因素分析使用Cox比例风险模型对乳腺癌患者的年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、组织学分级、分期以及GAB1表达情况分别进行单因素分析。结果显示，淋巴结转移、分期以及GAB1表达与患者无复发生存密切相关。对以上所有因素再进行多因素分析，结果显示，分期(P=0.024，HR=1.888，95%CI=1.086～3.284)和GAB1表达(P=0.010，HR=1.932, 95%CI=1.170～3.189)是影响患者无复发生存的独立预后因素(表2)。

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其病因尚未完全清楚，一旦进入晚期，就容易发生复发和转移。在中国，2020年新增乳腺癌病例42万例，死亡人数约为12万[1]。三苯氧胺作为ER阳性乳腺癌患者的主要治疗药物，明显提高了患者的生存率，然而，30%的患者在接受三苯氧胺治疗过程中出现耐药，导致在5年内发生复发和转移[6]。

GAB1基因定位于人染色体4q31.1，其蛋白由694个氨基酸残基组成，能被多种受体或非受体酪氨酸激酶激活，受生长因子、细胞因子、抗原和其他分子的刺激而发挥多种促癌功能[7]。GAB1蛋白通过参与多种原癌基因表达，从而参与调控与肿瘤相关的信号转导通路影响肿瘤的发生、侵袭和转移[8]。GILLGRASS等[9]在ErbB2诱导的乳腺肿瘤研究中发现，EGFR依赖的GAB1蛋白的激活能促进肿瘤发生发展。ORTIZ-PADILLA等[10]在一项乳腺癌基因突变筛查中发现，GAB1的两个体细胞发生突变(Y83C和T387N)，通过对这两个突变体功能的研究发现，GAB1信号的异常表达可直接促进乳腺癌的进展。

本研究发现，GAB1在ER阳性乳腺癌组织中高表达，且GAB1的表达与淋巴结转移和肿瘤分期相关。通过体外实验发现，干扰GAB1可明显抑制ER阳性乳腺癌细胞系MCF-7细胞的侵袭和迁移能力。EMT是指上皮细胞到间质细胞的转化，在细胞侵袭迁移、细胞外基质改变和细胞凋亡等过程中发挥着重要作用，其中以上皮标志物E-cadherin的减少或缺失和间质蛋白标记物vimentin蛋白表达上调为主要特征[11]。为了进一步研究GAB1与转移的关系，本研究通过Western blotting法检测GAB1对EMT相关因子E-cadherin及Vimentin表达的影响发现，干扰GAB1表达后，E-cadherin的表达明显增高，而Vimentin的表达明显降低。以上结果提示了GAB1高表达和乳腺癌的发生发展和侵袭转移密切相关。

HU等[12]通过体内外实验研究发现，在乳腺癌中，突变体Shp2显著促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，至少是部分通过激活GAB1-RAS-ERK信号轴来实现的，这一发现对于乳腺癌的治疗有重要意义。CHEN等[13]通过高通量筛选500个化合物得到5个靶点，这些靶点与GAB1PH结构域具有很强的结合亲和性，能够抑制GAB1的磷酸化，并对MDA-MB-231和T47D乳腺癌细胞系发挥肿瘤特异性细胞毒性作用；该研究发现了针对GAB1PH结构域抑制剂的新药，具有乳腺癌靶向治疗的潜力，对指导未来基于结构的药物设计提供了新的思路。本研究通过单因素和多因素生存分析发现，GAB1高表达组患者的无复发生存率更短，且GAB1是影响患者无复发生存的独立预后因素。这提示GAB1高表达与ER阳性乳腺癌患者不良预后密切相关。

综上所述，GAB1在ER阳性乳腺癌中高度表达，与乳腺癌的转移相关，可能是评估ER阳性乳腺癌患者预后的潜在靶点，也为ER阳性乳腺癌的治疗提供新的依据。后续我们将通过体内试验对GAB1表达与乳腺癌转移的分子机制进行进一步探讨，为深入挖掘促进乳腺癌转移的机制提供新的证据。