HPLC测定特殊医学用途电解质配方食品中罗汉果甜苷V含量

柳 俊，李汉西，黄琪评，曾德猷，卢韵君

（广州纽健生物科技有限公司，广东 广州 510663）

特殊医学用途配方食品（简称：特医食品），根据我国相关标准中的定义，这类食品是“为了满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需要，专门加工配制而成的配方食品。该类产品必须在医生或临床营养师指导下单独食用或与其他食品配合食用”。

特殊医学用途电解质配方食品主要含有碳水化合物及钠、钾、镁、磷等电解质，其蛋白质、脂肪、膳食纤维的含量为零，主要用于临床手术患者术前饮用。患者术前口服电解质配方食品可减轻围手术期胰岛素抵抗和不适症状，如饥饿、口渴、恶心或焦虑，缩短住院时间[1]。由于其含有丰富的电解质，临床上很多术前患者反馈产品口感不佳，因此，为改善产品口感，增强患者服用依从性，故在配方中添加纯天然植物代糖罗汉果甜苷。一方面，罗汉果甜苷的甜味持续时间长、后味持久，可明显改善产品口感，另一方面，罗汉果甜苷为纯天然植物代糖，安全无毒，且不存在糖代谢负担[2]。

目前，国内外关于食品添加剂罗汉果甜苷的检测，主要涉及原料、普通食品及药品，尚未见有特医食品中罗汉果甜苷含量测定的文献报道。为了更好的控制产品质量，本试验建立测定特殊医学用途电解质配方中罗汉果甜苷含量的HPLC方法。该法简便，结果准确，适用于该类产品的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料

罗汉果甜苷V标准品（来源：Stanford Analytical Chenicals Inc，批号：88901-36-4）；乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯，蒸馏水为双蒸水；特殊医学用途电解质配方食品（广州纽健生物科技有限公司）。

1.2 主要仪器

UltiMate3000系列高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，紫外检测器，工作站Chromeleon 7）；BSA223S电子分析天平（Sartorius）；UV-250分光光度计（日本岛津）；SB25-12DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱测定条件 Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1 %磷酸溶液:乙腈（76:24）；流速：1.0 ml/min；检测波长；203 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取罗汉果甜苷V对照品适量，精密称定，置入10 ml量瓶，用70 %乙腈溶解并定容。

1.3.3 供试品溶液的制备 称取供试品约1 g，精密称重，置入10 ml量瓶，加70 %乙腈8 ml，加塞，超声处理20 min，放冷，用70 %乙腈定容至10 ml，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。临用前，用0.45 μm微孔滤膜过滤。

1.3.4 阴性供试品溶液的制备 参照产品工艺过程制备缺罗汉果甜苷的阴性产品，照“1.3.3”项下制备缺罗汉果甜苷阴性供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱测定方法的选择

取罗汉果甜苷V对照品溶液进行紫外波长扫描，结果表明，罗汉果甜苷V在波长203 nm处有强吸收峰，因此选定203 nm为检测波长。通过文献调研[3-9]及试验验证对多种流动相条件进行对比，最后选定用0.1 %磷酸溶液:乙腈=76:24为流动相，流速为1.0 ml/min。

2.2 专属性试验

阴性供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，结果表明，在罗汉果甜苷相同的保留时间处基本无色谱峰，说明阴性制剂对所测组分无干扰。HPLC色谱图见图1 ～图3。

图1 罗汉果甜苷V对照品色谱图

图3 阴性供试品色谱图

2.3 线性试验

分别精密吸取不同浓度罗汉果甜苷V对照品溶液（每1 ml中含罗汉果甜苷V分别为0.005，0.01，0.015，0.02，0.04，0.05，0.08，0.1 mg）10 μl进行色谱测定，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积（Y）对罗汉果甜苷V含量（X）进行回归，得标准曲线：Y=39.5494X+0.0108r=0.9997。表明罗汉果甜苷V在含量0.05 ～1.0 μg范围内呈线性关系。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μl重复进样8次，测得峰面积积分值RSD为0.93 %，表明精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批号的供试品，按“1.3.3”项下方法操作，平行制备6份供试品溶液，按色谱条件测定，计算含量，罗汉果甜苷平均含量为每100 g含25.201 mg，RSD为3.29 %。表明分析方法的重复性良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液10 μl，分别于0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，21和24 h按上述色谱条件测定，测得峰面积积分值RSD为1.10 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品约1 g，共9份，分别精密加入一定量的罗汉果甜苷V对照品（1 ～3号样品按样品中罗汉果甜苷含量的80 %添加，4 ～6号样品按样品中罗汉果甜苷含量的100 %添加，7 ～9号样品按样品中罗汉果甜苷含量的120 %添加），按“1.3.3”项下的供试品溶液的制备方法处理，按上述色谱条件测定，结果见表1。结果表明，回收率在95 %～105 %区间，RSD为1.59 %，表明方法回收率较好，准确度较高。

表1 回收率试验结果

2.8 耐用性试验

本试验考察波长、流速、温度、流动相比例、流动相磷酸溶液浓度发生微小变化时对本品含量测定的影响程度。

波长：考察201和205nm检测波长变化对罗汉果甜苷含量检测的影响程度。

流速：考察0.8和1.2 ml/min流速对罗汉果甜苷含量检测的影响程度。

温度：考察28和32 ℃温度对罗汉果甜苷含量检测的影响程度。

流动相比例变化：考察0.1 %磷酸溶液:乙腈为74:26，78:22流动相比例对罗汉果甜苷含量检测的影响程度。

流动相：0.08 %和0.12 %磷酸溶液对罗汉果甜苷含量检测的影响程度。

结果表明，不同色谱条件下，罗汉果甜苷含量检测值RSD为4.11 %，表明当色谱条件发生微小变化后，对本品含量测定结果无明显影响。因此，认为本方法耐用性良好，满足含量测定要求。

3 讨论

试验对供试品中罗汉果甜苷提取的影响因素进行了考察，分别采用水、50 %甲醇溶液、50 %乙腈溶液、70 %甲醇溶液、70 %乙腈溶液为提取溶剂，超声10，20，30和40 min，结果表明70 %乙腈溶液作为提取溶剂，超声20 min时提取率最高。

特医食品作为临床患者首选的营养补充剂，通常服用量较大且服用时间较长，因此，产品的安全性显得尤为重要。本研究特殊医学用途电解质配方食品中甜味剂选用纯天然甜味剂罗汉甜苷，其甜度和安全性均较高[10]，在改善口感的同时也能有效降低甜味剂给临床患者带来的潜在安全风险。《食品安全国家标准-食品添加剂使用标准》（GB2760-2014）中特殊膳食用食品中可以使用的甜味剂除了罗汉果甜苷外，还有乳糖醇、赤藓糖醇和木糖醇，这些糖醇虽然安全性较高，但是甜度较低，配方用量较罗汉果甜苷相比大1 ～2个数量级，不符合特医食品的配方设计原理。

本研究采取HPLC法测定特殊医学用途电解质配方食品中罗汉果甜苷的含量，主要目的是通过测定产品中罗汉果甜苷分布情况判定产品中各营养成分的混合均一性。作为甜味剂，通常罗汉果甜苷是配方中最小组分，其分布的均匀性能很好地代表混合体系的均匀性，参照美国FDA《混合均匀性取样和评价指南》的规定，不同位点的评价指标RSD在5 %以内，表明混合均匀[11]。这也是本研究的主要意义之一。

本实验主要针对特殊医学用途电解质配方食品中罗汉果甜苷的测定，由于特医食品中电解质配方、增稠组件和碳水化合物组件的配方类似，因此，本研究对于以上3类特医食品中罗汉果甜苷的测定具有一定的适用性，至于其他类别的特医食品，还需要进一步研究确认。