HPLC法同时测定大黄蛰虫片中3种成分的含量

王 昱，白 洁，张志强，张隶涛，孙 菡*

（1. 秦皇岛市药品不良反应监测中心，河北 秦皇岛 066000；2. 河北省药品医疗器械检验研究院，河北 石家庄 050000）

大黄蛰虫片是由熟大黄、土鳖虫、虻虫、水蛭、白芍、黄芩、甘草等十二种药味加工而成的中药成方制剂，为汉代名医张仲景所著《金匮要略血痹虚劳篇》中的经典名方，具有活血破瘀，通经消痞之功效，临床上广泛用于肝病、妇科疾病、心脑血管疾病等的治疗，该品种质量标准收载于国家药品标准 YBZ12252005-2012Z-3[1-4]，标准中仅收载了大黄中大黄素、大黄酚的含量测定方法。本次研究为了更高效地控制中药成方制剂质量，采用高效液相法进行多指标同时测定方法研究[5-10]，以处方中白芍、黄芩、甘草的指标性成分为质控基础，建立了同时测定3种成分含量的测定方法。该方法操作简便，方法准确，为本品质量控制提供了更加全面有效的定量分析方法。

1 实验材料

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；Boston C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；AE240分析天平（Metler精密仪器分析公司，感量0.01 mg）；KQ -500KDE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司500W 40 kHz）。

1.2 试剂试药

对照品：黄芩苷（批号110715-201318），甘草苷（批号111610-201106），芍药苷（批号110736-201741）均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

样品：大黄蛰虫片，广西玉林制药集团有限责任公司提供，批号分别为：860003，860005，860007，860008，860009，860030，860032，860034，860036，860037。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Boston C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）。

流动相：以乙腈为流动相A；以 0.1 mol/L磷酸为流动相B；按表1中的规定进行梯度洗脱；柱温：30 ℃。流速为1.0 ml/min；测定波长230 nm。理论塔板数：需按芍药苷峰计算不得低于3000；各峰与相邻峰的分离度均大于1.5。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别取3种待测成分对照品约 10 mg，精密称定，加甲醇分别制成每1 ml含芍药苷、黄芩苷各200 μg，甘草苷100 μg溶液。各精密量取5 ml，置入20 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品20片，称定重量，研细，精密称取1 g，精密加入70 %乙醇溶液25 ml，称定重量，超声处理30 min，用70 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 专属性试验

按标准中[处方]及[制法][2]项下制备白芍、黄芩、甘草阴性样品，按上述2.2.2项下制备阴性样品溶液。分别精密吸取芍药苷、甘草苷、黄芩苷的混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 µl，按“2.1”项色谱条件测定。结果样品色谱中，在与对照品色谱相应位置显相同保留时间色谱峰，而阴性样品色谱的相应位置无色谱峰，阴性不干扰测定。结果见图1。

图1 大黄蛰虫片中芍药苷、甘草苷、黄芩苷含量测定图

2.4 精密度试验

取混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样5次，芍药苷、甘草苷、黄芩苷峰面积RSD分别为0.5 %，0.9 %，0.6 %，结果表明，仪器精密度良好。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下各对照品溶液适量，加甲醇配置成系列浓度对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录所有的峰面积。以色谱峰面积为纵坐标，对进样量（μg）为横坐标绘制3种成分的标准曲线。结果表明，各待测成分线性关系良好，线性回归方程见表2。

表2 线性回归方程

2.6 重复性试验

取大黄蛰虫片样品（批号：860032），精密称取0.5，1.0，1.5 g各3份，共取9份，按 “2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果表明，芍药苷、甘草苷、黄芩苷平均含量分别为0.815，0.123，1.212 mg/g；RSD分别为1.3 %，1.8 %，0.9 %，结果表明，本方法重复性良好。

2.7 准确度（回收率）试验

采用高、中、低3个浓度对照品加于样品中的回收测定法。取大黄蛰虫片样品（批号：860032，含量以重复性结果计）9份，每份0.5 g，精密称定，分别精密加入高、中、低3个浓度对照品70 %乙醇溶液25 ml，每一种浓度测定3份，按照 “2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果表明，芍药苷、甘草苷、黄芩苷平均回收率分别为99.7 %，97.6 %，97.9 %；RSD分别为1.9 %，1.4 %，1.3 %，结果表明，本方法准确度良好。

2.8 稳定性实验

取大黄蛰虫片按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，于0，3，6，15，20，24 h分别进样10 μl，测定其芍药苷、甘草苷、黄芩苷峰面积，芍药苷、甘草苷及黄芩苷峰面积的RSD分别为1.1 %，1.2 %，1.7 % 。结果表明，供试品溶液24 h稳定性良好，

2.9 样品测定

取10批大黄蛰虫片，按照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积结果，并根据外标法计算含量，测定结果见表3。

表3 样品测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

由于该系统需要同时检测的3种成分，无法用等度洗脱的方式，只能通过改变流动相中水相以及有机相的比例随时间的变化规律，使3种成分达到分离。本实验通过比较多种不同流动相及梯度洗脱程序下各成分的分离度及峰形，最终确定该流动相洗脱系统。

3.2 检测波长的选择

采用DAD 检测器进行全波长扫描（200～500 nm），分析3种化合物的紫外光谱，并综合考虑检测时3个色谱峰的响应，及遇到各个影响因素，结果表明，3种化合物（芍药苷、甘草苷及黄芩苷）在检测波长为230 nm 时，分离成分的效果良好。最终选择230 nm 为本实验的检测波长。

3.3 耐用性实验

为使本方法在应用中能不受设备、色谱柱及其他条件变化的限制，研究中在多条件下进行了验证试验。验证使用Boston C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；资生堂C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；Acclaim 120A（4.6 mm×250 mm，5 µm）C18色谱柱；安捷伦1260、岛津20AT、Waters2695高效液相色谱仪及柱温、流动相pH、流动相比例微小变化项的耐用性考察。结果表明，芍药苷、甘草苷、黄芩苷的定性重复性与定量重复性偏差RSD均在2 %以内，各条件下色谱峰均分离效果较好，测定最终的结果基本保持了一致，表明方法耐用性较好。