高效液相色谱法同时测定双黄消炎片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量

孟庆山，马芳芳，巩腾飞，李琳琳

（威海市食品药品检验检测中心，山东 威海 264200）

双黄消炎片是由三颗针、黄芩两味中药组成，收载于《卫生部药品标准》第二册（WS3-B-0235-90）[1]，具有消炎功效，用于咽喉疼、腹泻、痢疾、慢性痢疾，是应用于临床的常用消炎药物之一。在《中国药典》2020年版一部中将盐酸小檗碱做为三颗针含量测定的指标成分，将黄芩苷做为黄芩含量测定的指标成分[2]，而现行的药品标准相对简单，没有含量测定项目，不能有效控制药品质量。目前，对双黄消炎胶囊中单一成分的含量测定方法已有报道[3-6]，但这些方法不利于快速全面检验，尚未见用高校液相色谱法（HPLC）同时测定盐酸小檗碱、黄芩苷2种指标成分的报道。因此，本文建立了HPLC同时测定双黄消炎片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量测定方法，该方法操作间简单、准确，专属性、重现性好，能为该产品质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（LC Solution工作站）；MS105DU型电子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-250DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110713-201814，含量86.7 %）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110715-201821，含量95.4 %）；双黄消炎片（厂家A，批号：08171006；厂家B，批号：18120161；厂家C，批号：190701，规格：0.4 g/片），乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：InertSustain C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A），0.05 mol/ L磷酸二氢钾溶液（B），梯度洗脱（程序见表1）；流速为1.0 ml/min；检测波长265 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱、黄芩苷对照品适量，加甲醇超声溶解，制成盐酸小檗碱0.2150 mg/ml，黄芩苷0.5128 mg/ml的混合对照品溶液Ⅰ，精密量取10 ml置入50 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅱ。

2.2.2 供试品溶液制备 取样品20片，研细，取约0.15 g，精密称定，置100 ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）40 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 按双黄消炎片处方工艺分别制备不含三颗针的阴性对照和不含黄芩的阴性对照，按“2.2.2”项下方法分别制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验 分别取混合对照品溶液Ⅱ、供试品溶液以及阴性对照溶液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。结果表明，在本实验条件下，供试品色谱图中主峰保留时间与对照品色谱图主峰保留时间一致；对照品溶液和供试品溶液中盐酸小檗碱、黄芩苷的理论塔板数均大于8000，与相邻峰的分离度均大于1.5；阴性对照表明，其他组分对盐酸小檗碱、黄芩苷的测定无干扰，满足定量要求，见图1。

图1 各成分HPLC色谱图

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液Ⅰ 1，2，5，10，15，20 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件分别精密吸取10 μl，注入液相色谱仪测定，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内呈良好的线性关系。

表2 线性关系考察结果

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液Ⅱ 10 μl，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测得盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积的RSD分别0.30 %，0.34 %，结果表明精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批样品（批号：08171006），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”所述色谱条件进行测定。测得盐酸小檗碱、黄芩苷平均含量分别为12.50，60.70 mg/g，其RSD分别为0.28 %，0.26 %，表明方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于配制后0，3，6，9，12，15，18，21 h进样，测得盐酸小檗碱、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.72 %，0.45 %。结果表明，供试品溶液室温放置21 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收试验 取已知含量的同一批样品（批号：08171006）细粉约0.075 g，精密称定，共9份，平均分为3组，按低、中、高浓度分别加入混合对照品溶液（盐酸小檗碱、黄芩苷浓度分别为0.1066，0.5304 mg/ml）各8，10，12 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.3.7 样品测定 取样品3批，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，照“2.1”项色谱条件测定，每个批号平行测3次，结果见表4。

表4 样品中各成分含量测定结果（/mg·g-1，n=3）

3 讨论与结论

3.1 指标成分的确定

参照《中国药典》2020年版一部及相关文献报道[2-6]，结合双黄消炎片处方中2味药材主要成分及各成分性质，最终选择盐酸小檗碱、黄芩苷作为含量测定的指标成分。

3.2 色谱条件选择

3.2.1 流动相 本实验考察了乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.2 %磷酸、乙腈-0.4 %磷酸、乙腈-甲醇-0.2 %磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相等度和梯度洗脱[7-11]，发现乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相梯度洗脱，指标成分达到基线分离，色谱峰峰形和分离度较好。

3.2.2 检测波长 本实验两个指标成分最大吸收波长各不相同，黄芩苷最大吸收波长是276 nm和315 nm附近，盐酸小檗碱最大吸收波长是264 nm和346 nm附近[12]，考虑到样品种盐酸小檗碱含量相对较低，参考相关文献[2,13]，采取盐酸小檗碱优先的原则，选择265 nm作为检测波长，在此波长下黄芩苷也有良好的紫外吸收，故选择普适性较好的265 nm作为检测波长。

3.3 供试品溶液制备方法

本实验考察了不同浓度的甲醇、乙醇作为提取溶剂，结果发现甲醇提取效果较好；同时考察了回流、冷浸、超声等提取方法，发现无明显差异，因此选择相对快捷简单的超声提取；考察超声时间30，40，50，60，70 min进行，超声40 min时以上提取结果无明显差异，最终确定超声时间为40 min。

3.4 含量分析

不同厂家双黄消炎片指标成分含量存在较大差异，不同的生产工艺、药材来源、储存环境等均可能导致以上情况发生，提示生产企业应注意药材的质量控制；生产过程稳定、储存环境受控，提示监管部门加强该品种的质量监管。

3.5 结论

本文建立了HPLC法同时检测双黄消炎片中盐酸小檗碱和黄芩苷的含量，该方法基线稳定，分离度理想，线性关系和重现性较好，能满足检测要求，为双黄消炎片的质量控制研究打下了基础。