副鸡禽杆菌引起蛋鸡肿头病例的诊治

王馨玉 ， 刘激雨 ， 张 鑫 ， 张鸿宇 ， 胡君宜 ， 曲润康 ， 盖新娜 ， 郭 鑫 ， 孙洪磊

(中国农业大学动物医学院 农业部动物流行病学重点实验室 ， 北京 海淀 100193)

近年来，随着我国家禽养殖业集约化、规模化发展，鸡多病因呼吸道疾病成为冬春寒冷季节的常发疾病[1]。该类疾病的主要临床表现为病鸡呼吸困难、气管啰音，生长发育受阻，产蛋率降低；主要病理变化为鼻窦分泌物增多，喉头、气管黏膜充血、出血，肺脏淤血、水肿，气囊炎，兼有其他内脏器官病变。该类疾病的发生与应激因素刺激有关，诱发病毒、细菌、支原体等病原体混合感染。引起鸡多病因呼吸道疾病的病原主要包括禽流感病毒、新城疫病毒、禽偏肺病毒、传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体、副鸡禽杆菌和巴氏杆菌[2]。上述病原感染引起临床症状的相似性，给疾病的确诊带来困难，且不利于快速制定针对性治疗方案。现以一起由副鸡禽杆菌引起的蛋鸡肿头病例的诊断为例，为鸡多病因呼吸道疾病的鉴别诊断提供参考。

2019年1月初，河北省石家庄地区多家商品蛋鸡养殖场的产蛋鸡发生以面部肿胀、呼吸困难为主要特征的病症，该病发生后迅速蔓延至全群，1周后肿头症状好转，但蛋鸡产蛋量急剧下降并难以恢复，对养殖场造成较大的经济损失。结合对3家发病鸡场的临床诊断和实验室诊断，确定引起此病症的病原为血清B型的副鸡禽杆菌，将诊断过程报告如下。

1 发病情况与临床症状

2019年1月，河北省石家庄地区多家商品蛋鸡养殖场的产蛋期蛋鸡先后出现不明原因的肿头症状，病情发展迅速，发病率高达30%～60%，死亡率约为5%。发病初期鸡只精神不振、食欲减退、面部水肿，伴有甩头、打喷嚏、流浆液性鼻涕、张口呼吸等症状，部分病情严重鸡只颜面红肿，眼睑肿胀甚至失明，呼吸困难有啰音，鼻孔外结痂(中插彩版图1A)。发病1周后，鸡只的肿头症状减轻，但产蛋量大幅下降，出现软壳蛋和畸形蛋。发病鸡场均已免疫禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎疫苗及副鸡禽杆菌灭活苗(A+C型或A+B+C型)。

2 病理剖检变化及组织病理学观察

对病鸡进行剖检观察，颜面部皮下、眶下窦内可见大量黄白色胶胨样渗出(中插彩版图1B)；鼻腔内有黏液，鼻甲部存在大量呈灰白色黏液状或黄白色干酪样的渗出物(中插彩版图1C)；气管、肺脏未见明显病变。病鸡卵泡充血、出血、液化、变形，成熟卵泡数量少(中插彩版图1D)；盲肠扁桃体肿胀出血，部分病鸡十二指肠淋巴滤泡肿胀。

取病变的鼻甲部组织，使用苏木精伊红染色法(H.E.染色法)制成组织病理切片，经显微镜观察可见鼻窦内有大量黏液及纤维素渗出，混有大量红细胞及炎性细胞(中插彩版图2A～2B)；鼻窦黏膜上皮细胞肿胀、增生，黏膜固有层大量淋巴细胞、巨噬细胞以及肥大细胞浸润，血管充血(中插彩版图2C～2D)。

3 实验室诊断

3.1 病原检测 对肿头症状较为严重的病鸡进行检测样本的采取，共采集包括病鸡口咽拭子、眶下窦、鼻甲、气管、肺脏、肾脏和气管灌洗液在内的20份样品，并使用研磨仪将样品充分研磨匀浆。提取上述样品的总RNA并进行反转录，将反转录后的cDNA作为模板，分别使用禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽偏肺病毒的特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，发现以上检测结果均呈阴性。提取上述样品的DNA作为模板，使用副鸡禽杆菌的特异性引物进行PCR扩增(上游引物：5′-GAAAAAGATGGTAGCCGTGT-3′，下游引物：5′-TAACCGCATCACATTTCG-3′,扩增片段长度为462 bp)，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，共有12份样品(10份鼻甲组织研磨液，2份气管灌洗液)扩增出与目的长度相符的条带。将上述阳性样品送至北京擎科新业有限公司进行序列测定，将测定结果与NCBI数据库中副鸡禽杆菌的参考序列进行同源性比对分析，结果显示，阳性样本的基因序列与副鸡禽杆菌参考株(VRDC/AvpgHNS/SZ)基因序列同源性达99.0%。

图3 副鸡禽杆菌特异性PCR检测结果1～19：待检病料样品； 20：阴性对照； M：5 000 bp marker

3.2 细菌分离培养及血清型鉴定 取病鸡鼻甲组织研磨液划线接种含有鸡血清和还原型辅酶I的TSA琼脂平板，于37 ℃、5% CO2条件下培养18～20 h后，可见灰白色、半透明、针尖大小菌落，进行革兰染色镜检可见革兰阴性小杆菌。挑取单菌落纯化培养，共得到2株分离菌株。参照Page凝集试验分型法，将纯化的菌株分别与A、B、C型3种标准阳性血清进行平板凝集试验，结果显示，2株分离菌均为Page B型。

4 讨论

结合病鸡的临床症状、剖检病变以及病原的分离鉴定和分型结果，确诊引起该病的病原为副鸡禽杆菌。副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)属于巴氏杆菌科、禽杆菌属、副鸡禽杆菌种[4]，可引起鸡急性上呼吸道感染，主要临床症状为鼻腔和鼻窦的炎症，同时伴有流涕、颜面肿胀、结膜炎等症状[5]。本病潜伏期短、传播迅速，发病率高、死亡率低，可造成育成鸡群生产停滞、淘汰率增加以及蛋鸡群产蛋率的显著下降[6]。Page等使用全细菌平板凝集试验和鸡的抗血清将副鸡禽杆菌分为A、B和C三个血清型[7-8]，各血清型之间无交叉保护性[6]。我国于1986年由冯文达在北京首次分离到副鸡禽杆菌，经鉴定为Page A型[9]，此后Page B型和C型鸡嗜血杆菌的分离情况也陆续被报道[10-11]。流行病学调查显示，近年来我国鸡传染性鼻炎的流行呈上升趋势，优势血清发生了从Page A型到Page B型的转换[12-13]。本病例中分离到的2株副鸡禽杆菌都属Page B型，进一步佐证了流行病学的调查结果。

由副鸡禽杆菌引发的疾病有明显的季节性，多发生于冬春季节，这与寒冷季节禽舍内“重保温，轻通风”的不良管理方式有较大关联。禽舍内空气不流通导致氨气浓度过高，刺激蛋鸡呼吸道，降低了其对副鸡禽杆菌的免疫力。被副鸡禽杆菌感染的病鸡出现流泪、鼻塞、颜面肿大等症状，在其频繁抓挠鼻部的过程中易继发感染垫料和环境中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。在原发和继发病原的共同作用下，病理反应产物堵塞上呼吸道，病鸡出现高热、呼吸困难和明显的肿头症状。因此，为预防该病的发生，养殖场应加强饲养管理，尤其注意禽舍的通风、卫生情况。

疫苗的免疫失败也是导致本病发生的不可忽视原因。副鸡禽杆菌各血清型之间的交叉保护性较弱，目前我国广泛使用副鸡禽杆菌二价或三价灭活疫苗，但其保护效果因菌株与流行血清型匹配程度及免疫原性的好坏而存在差异。在本病例中，发病鸡场均已免疫过副鸡禽杆菌灭活苗(A+C型或A+B+C型)，但至冬季仍发生疫情，说明疫苗菌株与当地流行菌株的血清型差异较大，保护效果不佳。流行病学调查和本病例的诊断结果显示，目前我国所流行的副鸡禽杆菌以B型为主，其对蛋鸡有较强的致病力[13]，因此研发针对B型或A、B、C三型流行菌株的高保护力疫苗对于副鸡禽杆菌的控制十分重要[14-15]。此外，副鸡禽杆菌主要感染寿命较长的蛋鸡，灭活疫苗仅可在短时间内提供保护，且目前对传染性鼻炎菌素的免疫持续时间的研究较少[15]。因此，及时监测抗体水平，探究疫苗能提供良好保护水平的时间，以制定科学合理的免疫程序，也是未来防控过程中必不可少的一环。

由副鸡禽杆菌引起的肿头病症潜伏期短、发病迅速，肿头和呼吸道症状易与低致病性禽流感、禽偏肺病毒病、大肠杆菌病和鸡传染性支气管炎等病症混淆，发病早期的错误诊断，是造成疾病迁延不愈、病鸡产蛋量下降的重要原因。因此，在诊断时应注意结合本病发病率高、死亡率低的流行病学特点，可采用病料涂片镜检和特异性PCR相结合的方法进行快速诊断。根据诊断结果，对发病鸡群紧急免疫相应血清型疫苗并联合应用抗生素药物，可使病情得到有效控制。