微小RNA-126对胃癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响及其机制▲

程若溪 赖铭裕 蒋莉萍 吴谢慧 梁 凯

(广西医科大学第一附属医院老年消化内科，南宁市 530021，电子邮箱:294213913@qq.com)

胃癌是世界范围内发病率较高的癌症，其发病率位于全球第5位，死亡率居全球第4位[1]。2019年，中国胃癌发病率约为43.1/10万，病死率为29.6/10万[2]，严重威胁我国人民的生命健康。因此，探索胃癌的发病机制至关重要。微小RNA(microRNA,miR) 是真核生物进化中出现的小核糖核酸，主要作用是抑制非必需遗传物质或转录物质，大多数miR由非编码或编码mRNA的内含子编码。miR长约22个核苷酸，通过与mRNA的3′非编码区结合，从而调控基因表达，发挥主要作用的是miR5′末端第2～7位的核苷酸[3]。大量研究显示，miR-126在肿瘤的发生中发挥重要作用[4-7]。高尔基体磷蛋白3(Golgi phosphoprotein 3， GOLPH3)是新近发现的一种癌基因，定位于反面高尔基体[8]。我们前期研究发现，胃癌患者外周血中miR-126呈低表达，而GOLPH3的表达与miR-126的表达呈负相关[9]。但miR-126是否通过GOLPH3调控胃癌细胞的生长、侵袭及转移尚不明确。因此，本研究通过慢病毒转染的方式构建miR-126沉默及过表达的胃癌细胞株，探讨miR-126对胃癌细胞增殖、侵袭、转移能力的调控作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院细胞库；RPMI-1640培养基购自Gibco公司(批号：8120394)；特级胎牛血清购自BI公司(批号：04-001-1ACS)。miR-126-mimic/miR-126-mimic-NC(批号：9748-2/LVCON220)及miR-126-inhibitor/miR-126-inhibitor-NC(批号：4783-1/LVCON137)慢病毒由上海吉凯基因公司提供。总RNA提取试剂TRIzol、反转录试剂、实时荧光PCR试剂及引物均购自大连Takara公司(试剂批号：9108、RR047A、RR820A)。高效RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂混合物、蛋白上样缓冲液购自索莱宝公司(批号:R0010、P1260、P1015)；GOLPH3单克隆抗体购于Abcam公司(批号：ab98023)；磷脂酰肌醇-3激酶调控亚基2(phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 2,PI3KR2)、蛋白激酶B 1(protein kinase B,Akt1)、磷酸化Akt1 (phosphorylated Akt1,p-Akt1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR( phosphorylated mTOR,p-mTOR)单克隆抗体均购自于CST公司(批号：ab180967、4691、4060、2983、5536)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体购自Bioworld公司(批号：AP0063)；荧光二抗购自Invitrogen公司(批号：SA5-35571)。细胞计数试验-8(cell count kit-8,CCK-8)试剂盒由美仑生物提供(批号：MA0218)。Matrigel matrix购自BD公司(批号：356234)。实验所用Transwell小室、培养皿、培养瓶孔板等均购自康宁公司(批号：3395、430167、430639)。

1.2 实验方法

1.2.1 miR-126过表达及沉默细胞株的构建与鉴定：将细胞分为4组进行实验，包括miR-126过表达组(miR-126-mimic组)、miR-126过表达阴性对照组(miR-126-mimic-NC组)、miR-126沉默组(miR-126-inhibitor组)、miR-126沉默阴性对照组(miR-126-inhibitor-NC组)，每组设置3个复孔。将人胃癌细胞株SGC-7901于5 % CO2、37 ℃温箱条件下培养至20%～30 %融合度，严格按说明书的操作步骤转染相应的慢病毒。转染72 h后观察荧光达90 %以上视为转染成功，嘌呤霉素药筛1周，用于后续实验。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测各组细胞中miR-126、GOLPH3、PI3KR2、Akt1、mTOR的mRNA相对表达水平：用TRIzol试剂提取各组细胞中的总RNA，提取的RNA经纯度检测合格后进行反转录，均按照说明书的步骤进行操作。应用美国ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪，采用SYBR方法进行实时荧光PCR定量扩增，反应体系为20 μL，包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL、 PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、cDNA 2 μL、RNase Free dH2O 6 μL；反应条件为95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s共40个循环。均按照试剂盒说明书进行操作。用2-ΔΔCT法计算其相对表达量。实验重复3次。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 蛋白免疫印迹法检测各组细胞GOLPH3、PI3KR2、Akt1、p-Akt1、mTOR、p-mTOR的蛋白相对表达水平：采用含有蛋白磷酸酶抑制剂混合物的高效RIPA裂解液裂解细胞，采用NanoDrop One型超微量核酸蛋白浓度分析仪(美国Thermo公司)测定蛋白浓度。将蛋白上样缓冲液加入裂解得到的蛋白样品中煮沸备用。采用10 %十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，按每孔总量800μg蛋白进行上样，80 V恒压电泳2.5 h。利用聚偏二氟乙烯膜湿法转膜，240 mA恒流转3 h。5 %脱脂牛奶室温封闭1 h。条带分别用兔抗人GAPDH(1 ∶10 000)、GOLPH3(1 ∶1 000)、PI3KR2(1 ∶1 000)、 Akt1(1 ∶1 000)、 p-Akt1(1 ∶800)、mTOR(1 ∶1000)、p-mTOR(1 ∶2 000)4℃孵育过夜。次日用荧光二抗(1 ∶20 000)室温摇床孵育1 h后，应用Odyssey型红外激光成像系统(美国LI-COR公司)扫膜显影。实验重复3次。

1.2.4 CCK-8法检测各组细胞增殖能力：取转染成功后处于对数生长期的各组细胞，胰酶消化后重悬计数，以每孔3 000个细胞种入96孔板中，于5 % CO2、37 ℃温箱条件下培养，分别于0 h、24 h、48 h、72 h时间点加入 CCK-8试剂(10 μL/孔)，孵育4 h后，使用Synergy H1型全功能酶标仪检测450 nm处吸光度(美国伯腾公司)。每组6个复孔，实验重复3次。

1.2.5 平板克隆实验：每组设置3个复孔。取转染成功后处于对数生长期的各组细胞，应用胰酶消化后重悬计数，以每孔200个细胞种入含5 mL 10 %胎牛血清培养基的6孔板中。5 % CO2、37 ℃温箱培养约14 d，出现肉眼可见细胞团时终止培养。弃上清后，磷酸缓冲盐溶液浸洗2遍，4 %多聚甲醛固定15 min，吉姆萨染液染色20 min，清洗晾干后拍照。计数每个培养孔内形成的克隆数。

1.2.6 划痕实验检测各组细胞愈合能力：用Marker笔在6孔板底部标记，使得每孔有6条线穿过，每孔加入5×105个对数生长期细胞，于5 % CO2、37 ℃温箱培养过夜。第2天采用10 μL枪头垂直于标记线划痕；磷酸缓冲盐溶液轻柔洗涤后加入含1%胎牛血清的培养基。置于5 % CO2、37 ℃温箱中培养，分别于0 h、12 h、24 h、48 h、72 h时间点进行拍照分析。愈合率=[(初始划痕面积—X时后划痕面积)/初始面积]×100%。每组设置3个复孔。

1.2.7 Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力：将Matrigel胶与RPMI-1640培养基以1 ∶8的比例混合，吸取90 μL置于上室中，放入37 ℃温箱孵育1 h使其凝固。取对数生长期细胞，胰酶消化后以2×105个/mL的浓度重悬于RPMI-1640中，吸取200 μL加入上层小室中。在下室加入600 μL 含10 %胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，放入37 ℃温箱孵育48 h。取出小室弃上清，磷酸缓冲盐溶液洗涤2遍，4%多聚甲醛固定30 min，移除甲醛后磷酸缓冲盐溶液洗涤2遍，结晶紫染色15 min，用棉签擦去上室中未穿过的细胞，干燥后显微镜下观察。迁移实验中，上室不加Matrigel胶，每孔加2×104个细胞，其余步骤同侵袭实验。以上实验每组均设置3个复孔。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示,由于为同质研究对象接受两种不同处理，故两组间比较采用配对t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-126过表达及沉默细胞株的鉴定 miR-126-mimic及miR-126-inhibitor各组转染效率均达90 %，见图1。实时荧光定量PCR结果显示，miR-126-mimic组miR-126的相对表达水平为(33.170±1.582)，高于miR-126-mimic-NC组的(1.000±0.000)(t=35.217,P=0.001)；miR-126-inhibitor组miR-126的相对表达水平为(0.579±0.119)，低于miR-126-inhibitor-NC组的(1.000±0.000)(t=-6.108,P=0.026)。

图1 miR-126-mimic组(A)及miR-126-inhibitor组(B)细胞转染情况

2.2 各组SGC-7901细胞的增殖能力的比较 CCK-8实验显示，24 h、48 h、72 h时，miR-126-mimic组的吸光度值均低于miR-126-mimic-NC组，而miR-126-inhibitor组的吸光度值高于miR-126-inhibitor-NC组(均P<0.05)，见表2。平板克隆实验显示，miR-126-mimic组克隆数为(47.334±6.110)个，少于miR-126-mimic-NC组的(72.334±3.786)个(t=-7.119,P=0.019);而miR-126-inhibitor组的克隆数(102.667±5.132)个则多于miR-126-inhibitor-NC组的(62.000±4.583)个(t=7.252,P=0.018)，见图2。

图2 4组SGC-7901细胞平板克隆实验结果

表2 不同时间点各组细胞的吸光度值的比较(x±s)

2.3 各组SGC-7901细胞的迁移能力的比较 miR-126-mimic组的迁移细胞数为(709.667±26.633)个，少于miR-126-mimic-NC组的(1 094.667±73.432)个(t=-14.246,P=0.005)；miR-126-inhibitor组的迁移细胞数为(1251.667±105.557)个，多于miR-126-inhibitor-NC组的(781.000±7.211)个(t=7.229,P=0.019)，见图3。在12 h时，各组细胞愈合率差异均无统计学意义(均P>0.05)；在24 h、48 h、72 h时，miR-126-mimic组细胞的愈合率均低于miR-126-mimic-NC组，而miR-126-inhibitor组细胞的愈合率则高于miR-126-inhibitor-NC组(均P<0.05)，见表3和图4。

图3 4组细胞的迁移能力(×200)

图4 4组细胞的划痕实验结果

表3 不同时间点各组细胞的愈合率的比较(x±s，%)

2.4 各组SGC-7901细胞的侵袭能力的比较 miR-126-mimic组的穿膜细胞数为(103.337±8.021)个，少于miR-126-mimic-NC组的(205.667±12.334)个(t=-7.989,P=0.015),而miR-126-inhibitor组的穿膜细胞数为(175.334±8.505)个，多于miR-126-inhibitor-NC组的(79.334±9.292)个(t=12.359,P=0.006)，见图5。

图5 4组细胞的侵袭能力(×200)

2.5 各组SGC-7901细胞中的GOLPH3、PI3KR2、Akt、mTOR的蛋白及mRNA相对表达水平，p-Akt1、p-mTOR的蛋白相对表达水平的比较 miR-126-mimic组GOLPH3、PI3KR2、Akt1、mTOR的蛋白及mRNA相对表达水平，以及p-Akt1、p-mTOR的蛋白相对表达水平均低于miR-126-mimic-NC组，而miR-126-inhibitor 组以上指标均高于miR-126-inhibitor-NC组(均P<0.05)，见表4、表5、图6。

图6 4组细胞GOLPH3、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白情况

表4 miR-126-mimic组和miR-126-mimic-NC组相关指标蛋白和mRNA的相对表达水平的比较(x±s)

续表4

表5 miR-126-inhibitor组和miR-126-inhibitor-NC组相关指标蛋白和mRNA的相对表达水平的比较(x±s)

组别nAkt1蛋白mRNAp-Akt1蛋白mTOR蛋白mRNAp-mTOR蛋白miR-126-inhibitor组31.252±0.0861.224±0.1230.478±0.0500.364±0.0461.301±0.0570.356±0.057miR-126-inhibitor-NC组31.044±0.0711.000±0.0000.362±0.0640.240±0.0451.000±0.0000.239±0.037 t值5.9295.4458.74222.0235.2367.270P值0.0270.0010.0130.0020.0010.018

3 讨 论

近年来，晚期胃癌治疗多采用联合化疗，但其总中位生存期仅约1年[10]，因此迫切需要寻找新的治疗靶点以提高胃癌患者总体生存率。靶向miR的治疗手段已逐渐被运用于临床，其中运用miR-34的模拟物治疗癌症的研究已进入第一阶段的临床试验[11]。研究表明，miR-126在肝癌、肺癌、宫颈癌等多种肿瘤中发挥抑制作用[12-14],我们前期研究也显示胃癌晚期患者血液中miR-126表达明显降低，提示miR-126可能抑制胃癌的进展[9]。为了进一步验证miR-126对胃癌的影响，本研究通过构建miR-126过表达及沉默胃癌细胞株，发现过表达miR-126可抑制胃癌细胞的活力和增殖，而抑制miR-126则会明显增强胃癌细胞的活力与增殖；同时，过表达miR-126可抑制胃癌细胞的侵袭和转移，抑制miR-126则会起到相反的作用。

GOLPH3编码于人类5p13染色体，定位于高尔基体的磷酸化蛋白，可通过蛋白质运输、糖基化等过程影响肿瘤的发生和发展[9，15]。Li等[16]发现，在食管鳞状细胞癌中GOLPH3可能为miR-126的潜在靶点。我们前期研究发现胃癌患者外周血中miR-126的表达与GOLPH3的表达呈负相关，双荧光素酶实验提示miR-126可靶向结合GOLPH3的3′-UTR；此外，胃癌患者血液中GOLPH3的表达量与其浸润深度与淋巴转移有关[9]。本研究结果显示，miR-126-mimic组GOLPH3 mRNA及蛋白相对表达水平均低于miR-126-mimic-NC组，提示miR-126可在体外抑制胃癌细胞GOLPH3 mRNA及蛋白水平的表达。由此推测，miR-126可靶向结合GOLPH3从而影响胃癌的发展。

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与多种生物学过程，是癌症中最常见的失调通路之一[17]。Fu等[18]研究发现，miR-126可通过调控PI3KR2/Akt/mTOR通路来降低乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的耐药性。沉默GOLPH3可抑制mTOR/p-mTOR的表达，并且抑制胃癌细胞的生长，促进其凋亡[19]。本研究结果提示，增强SGC-7901细胞中miR-126的表达，不仅可降低GOLPH3、mTOR、p-mTOR的表达，PI3K、Akt、p-Akt的表达同样受到抑制；而抑制SGC-7901细胞中miR-126的表达，则会明显增强GOLPH3以及PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表达。该结果表明，miR-126可能通过靶向调控GOLPH3的表达从而达到调控PI3K/Akt/mTOR信号通路的效果。

综上所述，过表达miR-126可抑制胃癌细胞的活力和增殖、侵袭和转移能力，其可靶向作用于GOLPH3调控PI3K/Akt/mTOR信号通路来影响胃癌的发生与发展。本研究进一步证实miR-126在胃癌中发挥肿瘤抑制作用，并丰富了其下游调控基因，为靶向miRNA治疗胃癌提供了新的理论依据。