脱色希瓦氏菌S12对十溴联苯醚的利用及其降解特性研究*

江利梅，聂丽君，牛显春，刘正辉c，毛玉凤，向音波

（1.广东石油化工学院a环境科学与工程学院；b生物与食品工程学院；c广东省石油化工污染过程与控制重点实验室，广东 茂名 525000；2.茂名市有机污染控制工程技术研究中心，广东 茂名 525000）

多溴联苯醚（Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）作为溴代阻燃剂被广泛应用于电子电器、石油化工和建筑材料等产品中，其共有209种同系物，目前，商品化的PBDEs种类主要包括五溴联苯醚（Penta-BDEs）、八溴联苯醚（Octa-BDEs）和十溴联苯醚（Deca-BDEs，又称BDE-209），且十溴联苯醚的使用量最大[1]。PBDEs是一类新型持久性有机污染物，具有致突变性和致癌性，其亲脂性和生物易累积等特点使其极易在生物体内蓄积，并通过食物链逐级放大[2]，尤其是Penta-BDEs和Octa-BDEs具有较高的生态毒性在全球范围内正在逐步禁用[3]。而BDE-209的环境和生态毒性尚未定论，因此，在全球仍被广泛使用[4]。我国BDE-209的产量和用量均位居世界首位，导致我国大气、水体和土壤中甚至人体血清中均检出非常高浓度的BDE-209[5-7]。PBDEs对环境和生物体的影响已成为研究者们关注的热点问题。

目前，降解PBDEs的方法主要有物理法，化学法和生物法[8]。物化降解法容易产生毒性更大的低溴代或者羟基化产物，而生物降解法由于成本低廉且可实现环境中PBDEs的原位生物修复而被普遍看好[9]。已报道发现，多种微生物能厌氧降解PBDEs，但其降解能力、降解程度和降解产物受微生物种类和降解底物结构的影响。例如，He等研究发现，BDE-209能被硫螺旋菌厌氧脱溴生成七溴和八溴代产物[10]。Lip等利用GY2菌群降解四溴联苯醚（BDE-49、BDE-99和BDE-100）混合物，研究发现GY2菌群对其降解速率分别为36.9、19.8和21.9nmol·d-1，产物降解为无溴代的联苯醚,降解率达到88%～100%,其中，脱卤菌属的生长与PBDEs的脱溴降解紧密相关[11]。此外，Huang等也研究发现，土壤中BDE-209的残余量与土壤微生物的生物量呈显著负相关关系，表明厌氧微生物能够代谢降解BDE-209并为自身生长提供碳源和能量[12]。本研究利用脱色希瓦氏菌S12作为降解菌，以BDE-209为目标底物，分析BDE-209对脱色希瓦氏菌S12生长的影响及其降解特性，为PBDEs污染原位生物修复提供参考数据。

1 实验部分

1.1 菌株来源

脱色希瓦氏菌S12（Shewanella decolorationis S12）由Xu等从广东某印染废水处理厂的活性污泥中分离纯化获得[13]。

1.2 试剂和仪器

BDE-209（AR纯度＞98%TCI公司）；PBDEs同系物（标准品AccuStandards公司）；二氯甲烷、二甲基亚砜和正己烷（色谱纯 德国CNW公司）。

QP2010型气相色谱-质谱联用仪(岛津公司);DU640紫外分光光度计（Beckman公司）;Bugbox厌氧工作站（Ruskinn公司）。

1.3 BDE-209及其代谢产物分析方法

将培养75d后的培养液,按水相∶有机相=2∶1（v/v）的比例，添加正己烷超声萃取，超声萃取3次，每次5min，收集萃取液到棕色容量瓶中，最后用正己烷定容，测定前取1mL萃取液用0.22μm有机相滤膜过滤至1.5mL棕色样品瓶中，利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）分析DBE-209及其代谢产物。代谢产物由中国科学院广州地球化学研究所分析，具体分析方法参照文献[14]。

1.4 BDE-209对脱色希瓦氏菌S12生长的影响

60mL棕色瓶中分别加入粉末状BDE-209（即添加以二氯甲烷助溶的BDE-209，将二氯甲烷完全挥发）、二甲基亚砜助溶的BDE-209和二甲基亚砜纯溶液（对照），然后按2%（v/v）接种量接种S12菌于培养瓶中，添加60mL无机盐培养液（即乳酸钠20mmol·L-1、丁二酸钠20mmol·L-1和酵母0.1%），30℃静置避光培养，定期取出1mL培养液用于分析OD600和电镜观察菌体细胞。

1.5 脱色希瓦氏菌S12降解BDE-209的特性

20mL棕色瓶中加入1.25mL二甲基亚砜助溶的浓度为800mg·L-1的BDE-209，使培养体系中BDE-209浓度为50mg·L-1，添加20mL无机盐培养液（即乳酸钠20mmol·L-1、丁二酸钠20mmol·L-1和酵母0.1%），然后按1%（v/v）接种量接种S12菌（OD600为0.5）于棕色培养瓶中，30℃静置避光培养，定期添加固态培养基成分并摇匀溶解。每组实验设3个平行，并设置一组不接S12的空白对照。

2 结果与讨论

2.1 脱色希瓦氏菌S12对BDE-209的利用特性

BDE-209在水中的溶解度极低，通常仅为20～30μg·L-1，但在助溶剂条件下其溶解性可大大提高。为了阐明脱色希瓦氏菌对BDE-209的利用特性，分别采用二氯甲烷和二甲基亚砜作为助溶剂，分析比较脱色希瓦氏菌S12在不同BDE-209浓度条件下的生长情况，结果发现，菌株S12对BDE-209的利用程度与所采用的助溶剂紧密相关，当以二甲基亚砜助溶时菌株S12能以BDE-209为厌氧呼吸的电子受体获得生长。例如，实验采用二氯甲烷助溶方式添加BDE-209，待二氯甲烷挥发完全后添加无机盐培养基，控制BDE-209在培养体系中的浓度分别为0、30、300和900μg·L-1，接种S12菌以后置于厌氧工作站30℃静置避光培养，间隔时间取出1mL培养液用于分析OD600值，结果见图1。

图1 不同浓度BDE-209对脱色希瓦氏菌S12生长的影响Fig.1 Effects of Different Concentrations of BDE-209 on the Growth of Shewanella Decolorized S12

在培养24h时，不同BDE-209浓度实验组测得的OD600值分别为：0.113（0μg·L-1）、0.120（30μg·L-1）、0.106（300μg·L-1）和0.087（900μg·L-1）。当BDE-209浓度低于理论水溶解度30μg·L-1时，S12菌体生长没有受到任何影响。相反，当BDE-209浓度大于30μg·L-1，菌体浓度随着BDE-209浓度的升高而减少，随着培养时间的延长，这种减弱生长的现象并没有得到解除。

但当把BDE-209的浓度增加到50mg·L-1并以粉末状态添加到培养基中时，却获得了另外的结果。虽然在24h前高浓度BDE-209同样抑制了S12菌的生长，但24h以后培养基中的酵母消耗完全以后，S12菌反而可以利用BDE-209获得生长。没有添加BDE-209的S12菌在24h前OD600获得增加，在24h后由于酵母的消耗OD600维持在0.014左右，而添加50mg·L-1粉末BDE-209的S12菌在24h前OD600增加仅为没有添加BDE-209的S12菌的一半，但是在24h后OD600却能维持在0.028左右。而当BDE-209以二甲基亚砜（DMSO）助溶方式添加到培养基中时，S12菌在24h前的生长也收到了抑制，OD600增加也仅为没有添加BDE-209的S12菌的一半。但是24h以后S12菌利用BDE-209生长的状态尤为明显，OD600基本维持在0.08以上（见图2）。

图2 不同溶解方式的BDE-209对脱色希瓦氏菌S12生长的影响Fig.2 Effects of BDE-209 with different dissolution methods on the growth of Shewanella decolorized S12

由图2结果可知，当BDE-209浓度低于理论水溶解度的30μg·L-1时，这种持久性有机污染物并没有对希瓦氏菌S12的生长产生影响，而高于这个浓度的BDE-209在培养前期（约24h）都会抑制S12菌的生长。如果BDE-209浓度达到一定程度如50mg·L-1时，在S12菌生长受抑制的情况下，BDE-209可以作为电子受体被还原从而为S12菌提供能量生长，这种维持生长状态以二甲基亚砜溶解态的BDE-209比粉末态的BDE-209更为明显。相反，如果BDE-209浓度没有达到一定程度时，则不能维持S12生长的需要，仅表现出生长受抑制的现象。

同时，对不同时间段的菌体细胞进行电子显微镜观察也证实了上述实验结果，22h时3个实验组的S12菌体细胞结构都完整；46h时没有添加BDE-209的S12大部分菌体细胞质开始出现凝结，而添加BDE-209实验组的S12菌细胞结构保持完整，且细胞外膜覆盖有较松散的物质；70h时，没有添加BDE-209的S12菌体大部分开始死亡，而添加BDE-209的S12菌体细胞结构仍然保持完整。到了168h没有添加BDE-209的S12菌体基本死亡，而添加粉末状的BDE-209的S12菌体细胞液开始出现凝结，但添加DMSO溶解的BDE-209的S12具体细胞仍保持着完整结构（如图3），这也从另一方面说明BDE-209在营养物质酵母消耗完全以后可以维持S12生长的需要。这与huang等[12]的研究结果相一致。

图3 菌株S12与BDE-209不同接触时间的菌体电子显微镜图Fig.3 Electron micrograph of S12 at different contact time with BDE-209

2.2 脱色希瓦氏菌S12对BDE-209的降解特性

通过GC-MS分析研究S12菌对BDE-209的降解率及其代谢产物，发现培养75d后，S12对BDE-209的降解率为81.07%(空白对照为8.02%)，见图4。

图4 培养75d后BDE-209的降解率Fig.4 Degradation rate of BDE-209 after 75d incubation

其降解代谢产物主要为八溴代和九溴代产物，其中八溴代产物有BDE-201（2.124μg·L-1）、BDE-2022（2.029μg·L-1）、BDE-203（2.393μg·L-1）、BDE-196（1.725μg·L-1）和BDE-197（2.171μg·L-1）；九溴代产 物 有BDE-208（48.859μg·L-1）、BDE-207（76.718μg·L-1）和BDE-206（47.918μg·L-1），见图5。该培养体系中未测出七溴代及以下的代谢产物。这与Gerecke等报道的利用厌氧污泥为载体，BDE-209可被微生物还原脱溴生成九溴联苯醚和八溴联苯醚的结果一致[15]。虽然S12菌对BDE-209的降解率达81.07%，但检测到的代谢产物远低于降解值，原因可能是S12菌除了能还原脱溴降解外，还具有其他降解途径，如羟基化、甲基化或醚键断裂等[2]，而本样品前处理和分析检测方法未能检测到。

图5 降解产物的组成及含量Fig.5 Composition and content of degradation products

3 结论

（1）在二甲基亚砜助溶条件下，脱色希瓦氏菌S12能以BDE-209为厌氧呼吸的电子受体获得生长，实现BDE209的降解转化。该研究为进一步了解和掌握希瓦氏菌的生理生化特点，更好地利用微生物进行环境污染治理提供重要指导作用，但后续还需借助生物化学和分子生物学等技术手段深入分析微生物，利用BDE-209的相关代谢网络机理。

（2）脱色希瓦氏菌S12具有高效厌氧降解BDE-209能力，降解率为81.07%，这为进一步开展多溴联苯醚等持久性有机污染物的生物修复提供了宝贵菌种资源和参考数据。但后续仍需不断优化和改进代谢产物的分析方法，以便更好地追踪BDE-209的去路和降解途径。