基于网络药理学探讨新伤湿敷液治疗软组织损伤的作用机制

刘文龙 赵靖 张喜利 常铮 刘志军 葛金文

〔摘要〕 目的 采用网络药理学及分子对接技术探讨新伤湿敷液治疗软组织损伤的成分、靶点、通路三者之间的相互作用机制。方法 通过文献查找及TCMSP数据库获取新伤湿敷液活性成分，利用TCMSP及SWISS数据库获取对应靶标并与Gene Cards、OMIM数据库所获疾病靶标交集以得到核心靶点，基于STRING平台构建靶点相互作用网络并通过Cytoscape软件可视化复方-药物-成分-靶点-通路网络，Metascape数据库对核心靶点进行GO及KEGG可视化分析，最后将所得结果导入Sybyl软件进行分子对接。结果 分析得到新伤湿敷液中活性成分作用于56个核心靶点;且分子对接结果显示新伤湿敷液中emodin、baicalin、baicalein等成分与PIK3CA等靶点亲和力强。结论 新伤湿敷液中的活性成分可能通过作用于PIK3CA等靶点以调节Th17细胞分化、TNF、IL-17等通路以治疗软组织损伤。

〔关键词〕 软组织损伤;网络药理学;新伤湿敷液;分子对接;作用机制

〔中图分类号〕R285       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.014

〔Abstract〕 Objective Network pharmacology and molecular docking technology were utilized to explore interaction mechanisms among the components， targets and pathways of Xinshang Shifu Liquid in treatment of soft tissue injury. Methods The active ingredients of Xinshang Shifu Liquid were obtained from literature searches and TCMSP database， and corresponding targets were get from TCMSP and SWISS databases. Disease targets were retrieved via GeneCards and OMIM databases. Core targets were identified by intersecting disease targets with active ingredient action targets. Building a target interaction network based on STRING platform and through Cytoscape software to visualize the prescription-drug-component-target-pathway network. Metascapedatabase performs GO and KEGG visualization analysis on the core targets， and finally the results were imported into Sybyl software for molecular docking. Results It was analyzed that active ingredients in Xinshang Shifu liquides act on 56 core targets， and the molecular docking results showed that emodin， baicalin， baicalein and other compounds in the Xinshang Shifu Liquid have a strong affinity with PIK3CA and other targets. Conclusion The effective compounds in Xinshang Shifu Liquid may interact with PIK3CA and other targets， and regulate Th17 cell differentiation， TNF， IL-17 and other pathways to treat soft tissue injury.

〔Keywords〕 soft tissue injury; network pharmacology; Xinshang Shifu Liquid; molecular docking; mechanism of action

軟组织损伤系临床上一种常见性、多发性病症，常为软组织或骨骼肌肉受到直接或者间接暴力所致，患处多表现出肿胀、瘀斑、疼痛、压痛、出血、骨折、脱臼及功能障碍等症状[1-3]。近年来，各种意外所致的软组织损伤发生率较高且仍呈现上升趋势，软组织损伤性病患约占据骨科、针灸科、推拿科等科室就诊人次的50%～80%，严重影响了人们的生活质量[4]。软组织损伤在中医证候中属“筋伤”范畴，因血溢脉外、瘀血留滞，以致经脉不通、不通则痛，其本质被认为是瘀血阻络，治之以行气化瘀、消肿清热为主[5]。

新伤湿敷液为我院刘志军教授结合其数十年临床用药经验所组方剂，在临床上应用多年，其消肿止痛、散瘀活血方面疗效显著。本方由铁箍散、虎杖、千年健、红花、寻骨风等组成[2，6]，对其研究尚处于表观研究阶段，其作用机制及分子机制尚且未知。

中药复方因其多成分、多靶点、多通路的作用特点而难以揭示其分子作用机制[7]。网络药理学从药物多种活性成分与疾病靶点相互作用整体性出发，构建出“成分-靶点-通路”复杂的生物网络关系以预测药物作用于疾病的作用机制[8-10]，可为中药诊治现代化研究提供方法。故本研究结合网络药理学及分子对接技术，对新伤湿敷液中所含成分研究，分析其在软组织损伤中的作用靶点及相应机制，为后续研究提供一定的理论依据。

1 方法

1.1  新伤湿敷液化学成分及靶点筛选

采用TCMSP平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[11]检索新伤湿敷液中虎杖、千年健、红花、寻骨风的全部化学成分，根据其药代动力学参数设置口服吸收率（OB≥30%）、类药性（DL≥0.18）以筛选出活性成分，并基于其活性成分得到相应的潜在作用靶点。此外，通过文献检索铁箍散所含化学成分[12-13]，使用PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[14]得到其化学结构式并导入SwissADME数据库（http：//www.swissadme.ch/index.php），并经Swiss TargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）[15]预测靶点，录入可能性（Probability>0）的靶点。所得靶点均需经Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）[16]规范后标准化其命名。

1.2  疾病相关基因筛选

软组织损伤以“soft tissue injury”为检索词在“Gene Cards”数据库（https：//www.genecards.org/）[17]进行检索，以“OMIM”数据库（https：//www.omim.org/）[18]作为补充，查找相应软组织损伤相应靶点，所得靶点经Uniprot数据库规范后，剔除重复数据，得到最终疾病靶点基因。

1.3  成分靶点与疾病靶点的交集靶点获取

将新伤湿敷液筛选出的作用靶点映射到软组织损伤疾病靶点中，获得新伤湿敷液治疗软组织损伤的潜在作用靶点集，构建韦恩图。

1.4  靶蛋白相互作用网络的构建

通过STRING数据库（https：//string-db.org/）[19]，对1.3获得的共同靶点进行分析，设置蛋白种类为“homo sapiens”，交互作用评分为0.9，获取靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）图，使用Cytoscape 3.7.2软件cytoNCA功能[20]对交集的网络进行拓扑分析，计算各节点度值、介数、最短路径值、筛选出度值≥两倍中位数，介数、最短路径值≥中位数的所有靶点，即得核心靶点。

1.5  GO功能富集与KEGG通路分析

将核心靶点导入Metascape数据库（https：//metascape.org/），进行GO富集分析，探讨药物作用的生物学过程;进行KEGG分析，探讨药物作用的生物通路。最后以P<0.01为具有极显著性对数据筛选，筛选出中药主要有效成分及药物作用于疾病的潜在靶点与通路;将所得结果导入Cytoscape 3.7.2软件绘制出“复方-药物-成分-靶点-通路”网络图。

1.6  分子对接验证

对上述新伤湿敷液中的主要活性成分和软组织损伤核心靶基因进行分子对接，首先利用Cytoscape筛选出新伤湿敷液主要活性成分，在Pubchem数据库下载其3D结构式SDF格式，利用蛋白数据库RCSB PDB[21]获得解析度小于3？魡并具有配体的核心靶点蛋白，利用SYBYL软件对包含配体的蛋白受体，进行配体筛选、去水分子、修复残基、加氢等处理，采用 AMBER7 FF99力场能量优化后构建活性口袋，用Surflex-Dock模块进行对接并得到总分值，分值越高则配体与受体的结合能力越强[22]，并将新伤湿敷液活性成分与阳性药分子对比相应分值，分析结果。

2 结果

2.1  新伤湿敷液活性成分及靶点筛选

经TCMSP平台及文献檢索，检索出381个化合物，其中铁箍散58个、红花189个、虎杖62个、千年健45个、寻骨风27个，以TCMSP平台OB≥30%，DL≥0.18为条件及SwissADME数据库筛选并剔除无靶点对应成分后得出54个活性成分，铁箍散目前研究较少，故将其内已发现活性而未符合筛选条件的成分也列入本次考察。其中polydatin、resveratrol、emodin经文献调研[23]为虎杖主要活性成分，然未符合筛选条件，为保证预测准确性，故仍将其纳入筛选。活性成分根据其来源进行编号，共有成分以A、B、C编号并通过TCMSP及Swiss TargetPrediction数据库检索得到与活性成分相对应455个潜在作用靶点。见表1。

2.2  疾病相关基因筛选

通过GeneCards数据库与OMIM数据库，收集软组织损伤相关靶点基因并剔除重复值，共收集到3 991个疾病靶点基因。

2.3  交集靶点获取

将新伤湿敷液455个潜在作用靶点与3 991个疾病相关靶点基因经构建Venny图分析，得到新伤湿敷液作用软组织损伤330个交集靶点，其中铁箍散62个、红花168个、虎杖221个、千年健26个、寻骨风30个。见图1。

2.4  靶蛋白相互作用网络的构建

将所得330个交集靶点导入STRING数据库，限定条件为“Homo sapiens”，交互作用评分为0.9，得到蛋白间相互作用信息，进一步采用CytoNCA计算网络节点的度值、介数、最短路径值。通过数据值得出度值中位数为11.000 0，介数为104.153 8，最短路径值为0.063 9，故根据度值≥22，介数≥104.153 8，最短路径值≥0.063 9为综合筛选条件，筛选出330个交集靶点中的56个关键靶点（表2），进而得到PPI核心靶点网络图。见图2。

2.5  GO功能富集与KEGG通路分析

利用Metascape数据库，分别从生物过程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細胞组分（cellular component， CC）对56个核心靶点进行GO富集分析，分析核心靶点所参与的生物过程。以P<0.01为筛选条件，BP、MF、CC富集条目分别为1705、95、73条，选取前20位结果见图3。结果显示新伤湿敷液治疗软组织损伤作用靶点参与的生物学过程为细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）、转移酶活性的正调控（positive regulation of transferase activity）等;分子功能主要为激酶结合（kinase binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）等;膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）等细胞组分所占的比例最大。

进行KEGG信号通路富集分析获得新伤湿敷液治疗软组织损伤的148条信号通路，对部分结果可视化处理，结果见图3。提示新伤湿敷液治疗软组织损伤显著影响的信号通路为Th17细胞分化（Th17 cell differentiation）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）等，由KEGG分析可知前20条与软组织损伤有关通路主要集中在自身免疫应答、炎症因子方面。

将获得的药物、活性成分、核心靶点、KEGG通路信息构建多维网络图，从多维网络图各个节点之间的相互作用关系可获得复方-药物-成分-靶点-通路之间的关系，结果见图4。

2.6  新伤湿敷液主药有效化合物与其作用的软组织损伤靶点分子对接

新伤湿敷液中通过Cytoscape筛选出度值≥两倍中位值的活性成分，但筛选结果中未含铁箍散活性成分，为保证数据的完整性，纳入铁箍散活性成分度值前两位，故最终分析包括quercetin、luteolin、resveratrol、beta-sitosterol、emodin、baicalin、baicalein、beta-carotene、alpha-eudesmol、nerol。其在治疗软组织损伤中可能发挥重要作用，并从Drug bank搜索治疗软组织损伤非甾体药物ketorolac作为阳性对照。根据PPI网络筛选其核心靶点度值≥60的靶标，即PIK3CA、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、MAPK1、TP53。使用Surflex-Dock Screen与新伤湿敷液筛选所得10个主要活性物质与阳性药物进行对接，得到总分值。采用Sybyl-X 2.0软件对7个关键靶点蛋白与11个重要成分进行分子对接验证。完成对接模拟之后，根据关键药效分子和核心靶点最低结合能值绘制热图。见图5。另选取部分总分值较大的分子对接进行展示。见图6。

结果显示主要活性成分与核心靶标均有不同程度的结合，STAT3与MAPK1靶点仅有2组分分值大于阳性药物，PIK3CA有7组分，AKT1、SRC、TP53则存在8组分，所有组分与MAPK3的结合分值均大于阳性药物。故推测新伤湿敷液的主要活性成分发挥良好效应的靶点为MAPK3、AKT1等，而在STAT3、MAPK1靶点结合较差，影响其疗效的发挥。

3 讨论

软组织损伤导致的患处肿胀疼痛已经严重地影响了患者日常生活质量，新伤湿敷液作为湖南中医药大学常德附属医院院内制剂，在骨科诊室疗效显著且并未出现不良反应，现已被广泛应用于软组织损伤的临床治疗。然而新伤湿敷液治疗软组织损伤作用机制仍未进行系统性研究，故本研究应用网络药理学及分子对接技术，构建复方-药物-成分-靶点-通路网络，以探索其治疗软组织损伤的物质基础及作用机制。

本研究通过对新伤湿敷液进行网络药理学探索，筛选出其活性成分及交集靶点，并筛选出其主要活性成分。研究[24-25]表明，上述化合物多是通过抗炎及增强免疫系统活性来发挥其药理作用。其中，quercetin可抑制凝血酶和凝血因子活性，阻断纤维蛋白的形成[26]，使血不溢脉外以消肿;luteolin可抑制诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxygen synthase， iNOS）的表达及NO、活性氧（reactive oxygen species， ROS）的产生并激活抗氧化酶以抑制下游促炎细胞因子表达，同时下调NF-κB通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）通路以达到其抗炎作用[27]。resveratrol通过激活Sirtuin-1以抑制RelA乙酰化，进而下调NF-κB诱导的炎症因子表达[28]。beta-sitosterol可下调肽聚糖（peptidoglycan， PGN）诱导的炎症细胞因子IL-6和IL-8，并显著降低ROS的产生，刺激后可诱导HaCaT细胞抗炎蛋白血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）的产生[29]。emodin可显著下调大鼠TNF-α及iNOS蛋白表达，控制炎症发展[30]。此外，baicalin、baicalein在特定浓度下也表现出对炎症因子的调节作用[31]。beta-carotene则是通过抑制环氧合酶2（cyclooxygenase-2， Cox2）和TNF-α发挥有效的抗炎活性[32]。

根据PPI网络筛选其核心靶点PIK3CA、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、MAPK1、TP53，该类靶点度值均大于60，提示该类靶点互相作用良好并可能为新伤湿敷液主要作用靶点。PIK3CA为编码磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）的p110α催化亚基，目前的研究多针对其与肿瘤发生、侵袭、凋亡的密切关系，然PIK3CA亦与血管新生及通透性方面起重要作用，如miR-200b可抑制PIK3CA以达到调节新生血管的形成[33]。STAT3介导各种细胞因子和生长因子所引起的广泛的细胞反应，作用涉及细胞的生长、分化、增殖、恶性转化和凋亡、免疫调节等许多方面，目前研究表明STAT3通过其上游IL-6和TGF-β1以修复肌肉损伤及自身免疫性疾病[34]。Akt1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与炎症过程、心血管疾病、糖尿病等的发生发展。SRC是一种蛋白质酪氨酸激酶，研究[35]表明SRC激活可驱动促炎细胞因子的生成，使信号激活的SRC处于炎症微环境之内。MAPK1、MAPK3均归属于MAPK。其对炎症、应激反应的调控更为密切，可通过磷酸化NF-κB通路的IkB-α参与炎症及细胞增殖凋亡的调节[36]。TP53，系人体抑癌基因，有许多迹象表明p53蛋白在调节先天免疫系统中以及作为适应性免疫应答中的抗原方面都发挥了作用，如引起B细胞抗体应答和CD8杀伤性T细胞应答[37]。

此外，基于KEGG富集筛选出与炎症及免疫系统有关的靶点通路，其可能是新伤湿敷液消肿止痛的主要作用通路。其中Th17细胞分化，T细胞受体通路，IL-17通路、Th1和Th2細胞分化通路及B细胞受体通路均受到机体CD4 T细胞不同形式地调控，机体内CD4 T细胞感受炎症反应而激活后将部分分化为Th1和Th2细胞。其中Th1细胞负责产生干扰素、而Th2细胞则分泌相应因子以清除自身炎症反应[38]。而TNF通路参与了细胞生长、增殖、炎性及免疫等过程，当TNF通路被激活，该通路能够相应地诱导NF-κB脱离IκBα抑制而进入细胞核，从而激活下游NF-κB信号通路，并进一步促使TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的产生及释放，最终加重机体炎症反应[39]。同样地，NOD受体通路的激活也将促使炎症发生，NOD是一种重要的模式识别受体，该类受体主要表达为NOD1及NOD2，该类受体的活化也终将导致MAPK通路激活，表现形式为机体炎症反应加重。新伤湿敷液可通过正负调控上述通路以发挥其抗炎疗效。

综上所述，新伤湿敷液经网络药理学分析及分子对接验证，在分子生物学层次探讨了新伤湿敷液治疗软组织损伤的潜在靶点及作用机制。新伤湿敷液中主要包含quercetin、luteolin、resveratrol、beta-sitosterol、emodin、Baicalin、baicalein、beta-carotene等活性物质可能作用于PIK3CA、STAT3、AKT1、SRC、MAPK3、MAPK1、TP53等靶点，以抑制炎症反应、消肿止痛、促进血管新生等方向治疗软组织损伤。本研究为深入探索新伤湿敷液治疗软组织损伤提供了新的思路与方法，但本文仅进行了初步预测与理论分析，具体作用机制仍需实验手段进行深入研究验证。

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（本文编辑  苏  维）