miR-645靶向EDN3调控肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭

李豪 姬发祥 徐晓宁 马金华 沈存芳 李进章 王丽娟

(青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810000)

肝癌是临床常见恶性肿瘤且病死率极高，其病理基础较为复杂，目前临床主要采用根治术治疗肝癌但患者术后易复发〔1〕。既往研究显示肝癌靶向药物治疗成为主流，基因及蛋白表达异常与肝癌复发及转移等恶性特征有关〔2〕。因此积极研究基因及蛋白在肝癌发生及发展中的作用可为指导肝癌精准治疗提供参考。微小RNA-645(miR-645)在头鳞癌组织中表达上调并与头鳞癌的转移及预后密切相关，上调miR-645能够增强头鳞癌细胞增殖、侵袭、转移及单克隆形成等能力〔3〕。miR-645在结肠癌及肝癌组织中表达上调，抑制miR-645表达能抑制结肠癌细胞的增殖〔4，5〕。通过生物学信息软件预测内皮素(EDN)3是miR-645的靶基因，而EDN3基因在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌及神经胶质瘤等恶性肿瘤中表达水平明显降低并可能作为肿瘤靶向治疗的潜在靶点〔6～9〕。本研究旨在探讨miR-645在肝癌细胞中的表达并采用基因干扰技术抑制miR-645表达，分析miR-645表达量改变对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，验证miR-645与EDN3的靶向作用关系，旨在为肝癌靶向治疗提供新作用靶点。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721、BEL-7402与正常肝细胞株L02均购自上海生命科学院细胞库。杜氏改良培养基(DMEM)购自美国Gibco公司；胎牛血清与胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自上海阳光生物科技有限公司；miR-645 mimic及阴性转染质粒、miR-645抑制剂(anti-miR-645)、anti-miR-NC均购自广州易锦生物技术有限公司；EDN3 siRNA(si-EDN3)与阴性对照siRNA(si-NC)均购自美国Invitrogen公司；EDN3过表达质粒(pcDNA-EDN3)与对照质粒(pcDNA)均购自北京合生基因科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；Transwell小室购自北京优尼康生物科技有限公司；蛋白裂解液与二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Mgteigel基质胶购自美国BD公司；鼠抗人EDN3单克隆抗体购自武汉戴安生物技术有限公司；细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9单抗均购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；增强型化学发光试剂(ECL)购自美国Bio-Rad公司；Trizol、反转录及qRT-PCR试剂盒均购自日本Toyobo公司。

1.2细胞转染及分组 肝癌细胞与正常肝细胞株均培养于DMEM培养基，放入37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞生长汇合达到60%～70%时进行传代培养。收集对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后制备细胞悬浮液接种至6孔细胞培养板，放置在37℃、5%CO2培养箱培养，细胞生长融合至30%时进行转染，转染前更换为不含胎牛血清 DMEM培养基，分别用anti-miR-NC、anti-miR-645、miR-NC、miR-645 mimic及pcDNA-EDN3、pcDNA转染入肝癌细胞，实验分为anti-miR-NC组、anti-miR-645、miR-NC组、miR-645组、pcDNA-EDN3组、pcDNA组。为了验证EDN3对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用，分别将EDN3 siRNA、si-NC分别转染入anti-miR-645组肝癌细胞，分别为anti-miR-645+si-EDN3组、anti-miR-645+si-NC组。转染后12 h更换完全DMEM培养基，继续培养48 h，将转染成功的细胞用于实验。

1.3qRT-PCR检测细胞中miR-645及EDN3 mRNA表达水平 检测不同肝癌细胞株、正常肝细胞株及转染前后各组细胞中miR-645、EDN3 mRNA相对表达量，Trizol法提取细胞总RNA，反转录RNA得到cDNA，严格按照反转录试剂盒说明书进行操作，配置qRT-PCR反应体系，qRT-PCR条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，循环40次。采用比较阈值(Ct)法定量分析数据，miR-645以U6为内参基因，EDN3以GAPDH为内参基因。

1.4Western印迹检测EDN3、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表达 收集各组细胞后加入蛋白裂解液，12 000 r/min离心10 min提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白(蛋白上样量40 μg)，电泳结束后将其转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，BSA封闭1 h后置于4℃孵育过夜，分别加入各蛋白一抗，EDN3蛋白稀释比为1∶200，CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白稀释比均为1∶500，TBST洗涤，分别加入二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，ECL显色，X线胶片曝光后用蒸馏水清洗，利用凝胶分析系统分析各条带吸光度值。

1.5荧光素酶报告基因检测miR-372-3p靶基因 将荧光素酶报告载体WT-EDN3、MUT-EDN3分别与miR-645 mimic、miR-NC共转染HepG2细胞，转染36 h后收集细胞，根据荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测HepG2细胞相对荧光素酶活性(萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值)。

1.6MTT检测细胞增殖 收集对数生长期HepG2细胞，胰蛋白酶消化(浓度5×104个细胞/ml)，以每孔体积100 μl接种于96孔细胞培养板，每组均设置3个复孔，放置在温度37℃、相对湿度95%、体积分数5%CO2培养箱内培养，弃培养液，按照“1.2”进行转染，分别在转染后0、24、48、72 h加入MTT溶液(体积为20 μl/孔)，继续培养4 h后分别在每孔中加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡混匀，利用酶标仪检测波长为490 nm处各孔吸光度(OD)值。

1.7Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 用无血清DMEM培养基稀释Matrigel基质胶(稀释比1∶8)，将100 μl稀释液铺于Transwell小室底部的上室面，同时将各组转染HepG2细胞经胰蛋白酶消化后采用DMEM培养基重悬(2×105个/ml)，取200 μl细胞悬浮液置于Transwell小室上室，取含胎牛血清DMEM培养基600 μl加入Transwell小室下室，继续培养24 h后采用多聚甲醛固定，20 min后使用结晶紫溶液染色，15 min后用棉签擦拭Transwell小室内面细胞，置于显微镜下观察并随机选取5个视野计算侵袭细胞个数。细胞迁移实验中无需在Transwell小室底部的上室面铺Matrigel基质胶，其余步骤同细胞侵袭实验，实验结束后置于显微镜下观察迁移细胞个数。实验均设置3次生物学重复。

1.8统计学处理 应用SPSS21.0统计学软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-645和EDN3在肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402细胞和正常肝细胞L02中的表达 qRT-PCR检测结果显示，miR-645在不同肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402细胞中表达水平明显高于正常肝细胞L02(P<0.05)，而EDN3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；Western印迹检测结果显示，不同肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402细胞中EDN3蛋白表达显著降低(P<0.05)，见图1、表1。肝癌HepG2细胞中miR-645表达水平最高，EDN3 mRNA及蛋白表达最低，因此后续实验中主要以HepG2细胞为研究材料。

表1 miR-645和EDN3在肝癌HepG2、SMMC-7721、BEL-7402细胞和正常肝细胞L02中的表达

图1 EDN3蛋白表达

2.2miR-645靶向调控EDN3的表达 荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-645 mimic可明显抑制WT-EDN3的荧光素酶活性(P<0.05)，但miR-645 mimic对MUT-EDN3的荧光素酶无明显抑制作用(P>0.05)，见图2、表2。Western印迹法结果显示，miR-645组HepG2细胞中EDN3蛋白表达显著低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-645组显著高于anti-miR-NC组(P<0.05)，见表3，图3。

图2 EDN3的3′UTR中含有与miR-645互补的核苷酸序列

表2 双荧光素酶报告实验

表3 miR-645调控EDN3蛋白的表达

1～4：miR-NC组、miR-645组、anti-miR-NC组、anti-miR-645组图3 EDN3蛋白表达

2.3干扰miR-645表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭的影响 干扰miR-645表达后，采用qRT-PCR法验证沉默效果，结果显示anti-miR-645组HepG2细胞中miR-645表达水平较anti-miR-NC组明显降低(P<0.05)，提示沉默效果良好可用于后续实验。MTT法检测结果显示，培养48 h后anti-miR-645组HepG2细胞增殖活性明显低于anti-miR-NC组(P<0.05)。下调miR-645表达后HepG2细胞迁移及侵袭细胞数目显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)，见图4，图5，表4。anti-miR-645组HepG2细胞中CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表达显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)，而p21蛋白表达显著高于anti-miR-NC组(P<0.05)，见表5。

表5 干扰miR-645表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

图4 Western印迹检测相关蛋白表达

图5 HepG2的迁移、侵袭(×200)

表4 干扰miR-645表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭的影响

2.4EDN3过表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭的影响 pcDNA-EDN3组HepG2细胞中EDN3蛋白表达明显高于pcDNA组(P<0.05)。pcDNA-EDN3组HepG2细胞OD值(48、72 h)、迁移细胞及侵袭细胞数目均显著低于pcDNA组(P<0.05)。pcDNA-EDN3组HepG2细胞中CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表达显著低于pcDNA组(P<0.05)，而p21蛋白表达显著高于pcDNA组(P<0.05)，见图6、表6、表7。

表6 EDN3过表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭的影响

表7 EDN3过表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

图6 EDN3和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.5抑制EDN3表达逆转了干扰miR-645表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭的作用 相对于anti-miR-645+si-NC组，抑制EDN3表达后，流式细胞术检测结果显示HepG2细胞OD值(48、72 h)、迁移细胞及侵袭细胞数目增加(P<0.05)，p21蛋白表达明显降低(P<0.05)，而CyclinD1、MMP-2、 MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图7、表8、表9。

表8 抑制EDN3表达逆转了干扰miR-645表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭的作用

表9 抑制EDN3表达逆转了干扰miR-645表达对肝癌HepG2增殖、迁移、侵袭相关蛋白表达的作用

1～4：anti-miR-NC组、anti-miR-645组、anti-miR-645+si-NC组、anti-miR-645+si-EDN3组图7 EDN3蛋白表达

3 讨 论

肝癌患者复发率极高，细胞侵袭性强等病理特征造成临床治疗困难，由于肝癌发病隐匿导致患者确诊时已处于中晚期〔10〕。miRNA表达异常可通过调控靶基因表达进而影响肝癌发生及发展，研究表明部分miRNA可提高肝癌诊断敏感性及特异性，还可为肝癌治疗提供作用靶点〔11〕。因而探寻新型miRNA对肝癌细胞迁移及侵袭的影响有助于提高临床靶向治疗效果。

miR-645可通过调控下游靶基因表达进而参与乳腺癌细胞侵袭等生物学过程〔12〕。Chen等〔13〕研究表明miR-645可通过靶向GK5促进肾透明细胞癌的细胞转移和增殖。Feng等〔14〕研究表明miR-645还可作为致癌基因促进胃癌发生及发展过程。本研究结果说明miR-645可能参与肝癌发生过程。提示miR-645可能作为临床早期诊断肝癌的重要分子标志物。Wang等〔15〕研究表明长链非编码RNA LINC00161可通过调节miR-645-IFIT2轴使骨肉瘤细胞对顺铂诱导的细胞凋亡敏感。Cai等〔16〕研究表明抑制miR-645表达可通过靶向DCDC2抑制乳腺癌细胞转移。本研究采用基因干扰技术抑制miR-645表达，结果发现干扰miR-645表达后HepG2细胞增殖活性、迁移及侵袭细胞数目均明显降低。采用Western blot法检测细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达，结果表明MMP-2、MMP-9激活后可通过促进恶性肿瘤血管生成进而促进肿瘤细胞增殖及迁移，CyclinD1蛋白表达升高可促进恶性肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，p21可通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶激活进而抑制细胞增殖〔17〕。提示抑制miR-645表达可通过抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达并促进p21蛋白表达进而降低肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。但关于miR-645如何调控肝癌发生及发展相关信号通路仍需进一步研究证实。

EDN3在乳腺癌、结直肠癌及宫颈鳞癌等癌组织或细胞中均呈低表达并可抑制癌细胞迁移及侵袭能力〔18～20〕。本研究结果显示不同肝癌细胞中EDN3表达水平均明显降低，与上述研究结果相似。提示EDN3表达水平降低可促进肝癌发生。通过构建EDN3过表达质粒转染入肝癌细胞，结果提示上调EDN3表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。通过荧光素酶报告基因实验验证EDN3是miR-645的靶基因，miR-645可负向调控EDN3表达。为了进一步验证miR-645是通过负向调控EDN3蛋白表达而发挥作用，本研究将EDN3 siRNA及si-NC分别与anti-miR-645共转染入肝癌细胞，结果提示miR-645可通过调控EDN3表达进而促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。