乙醛脱氢酶2抑制4-HNE对心肌梗死模型大鼠的影响及作用机制

余永红 杨柳 杜艳华

(武汉市第四医院老年病科，湖北 武汉 430000)

目前临床中主要是通过减小患者心肌梗死的面积来达到治疗心肌梗死的目的，从而减轻患者心肌损伤程度，降低患者死亡率〔1〕。心肌梗死患者主要的临床症状是胸骨后疼痛，大部分患者会伴有心律失常、心力衰竭等并发症。数据显示，我国每年会新增60万例左右的心肌梗死患者，因此寻找安全有效的治疗方式至关重要〔2〕。乙醛脱氢酶(ALDH)2属于一种氧化乙醛酶主要存在于线粒体中，促织乙醛形成乙酸，并且对4-羟基壬烯醛(HNE)有分解作用，能够降低毒性醛类对细胞的损伤。相关研究指出，ALDH2活性减弱会阻碍乙醛分解，提高机体中乙醇代谢产物的浓度，造成乙醛在血液中凝聚，通过刺激肥大细胞，促使血管中活性物质释放，导致患者脸红、发音困难、低血压、出汗等症状发生〔3,4〕。4-HNE是脂质过氧化反应重要的醛基产物，在心肌中是主要的代谢酶抑制，促进破坏性蛋白在线粒中聚积，诱导产生ATP，对开放线粒体通透性转换孔有促进作用〔5〕。本文旨在研究ALDH2抑制4-HNE对心肌梗死模型大鼠的影响及作用机制，为其临床治疗提供数据支持。

1 对象与方法

1.1材料 研究动物：32只SD健康雄性大鼠，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，大鼠动物合格证号:11401500014592。鼠龄8～10周龄，平均(9.8±1.2)周龄，体重200～220 g,平均(210.4±5.2)g。所有大鼠在无病原菌的干净笼子里喂养，饮用水和食物均进行过消毒。本文研究经过医院伦理委员会批准。主要试剂：鼠抗人c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p53单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)。

1.2方法

1.2.1心肌梗死模型建立 参考靳文学等〔6〕文献，并进行适当修改。选取24只大鼠建立心肌梗死模型，具体操作步骤：使用浓度1%的40 mg/kg戊巴比妥钠将大鼠麻醉，进行常规消毒后固定，气管插管，使用动物呼吸机维持大鼠呼吸，选择大鼠左胸第3和4段肋骨用剪刀横切，再用镊子分离后打开胸腔，使心脏充分暴露。心包膜剪开后，使用10号医用缝合线将冠状动脉前支结扎，待心脏搏动减弱，Ⅱ导联心电图开始变化，ST段出现明显上抬，直到抬高到弓背向上，即为造模成功。分为模型组、ALDH2过表达组、ALDH2沉默组各8只，正常组8只。

1.2.2心功能指标检测 采用超声心动图检查大鼠的心功能，10%的水和氯醛溶液0.3 ml/kg进行腹腔注射，大鼠麻醉后，采取仰卧固定的方式在操作台上进行。使用Vivid7超声仪检查大鼠舒张末期左心室后壁厚度(LVPWD)、舒张末期室间隔厚度(IVSD)、左室舒张末期内径(LVDd)、左室收缩末期内径(LVDs)指标。

1.2.3病理学观察 所有大鼠在禁食和禁水后，断头处死，立即提取大鼠心肌组织标本，使用40 ml/L的多聚甲醛进行固定，常温下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙6 w，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，苏木素-伊红(HE)染色，观察。

1.2.4细胞转染 将四组大鼠心肌细胞，在培养瓶中进行培养融合，当细胞融合率在75%左右时，行胰酶消化，胰酶消化后终止消化(在新鲜的培养剂中)，使用细胞计数法测量终止消化后的细胞，测量出细胞密度后，将细胞种植于六孔板中，每个六孔板中大约种植4×105个细胞，加至新鲜的培养基中(3 ml)，之后进行孵育培养，在5%CO2、温度为37℃的培养箱中孵育，细胞孵育到融合率在40%～80%时，取1.5 μl的质粒DNA溶于100 μl的双抗培养基中(不含血清)，之后进行充分混合，混合均匀后进行离心处理至EP管底，在EP管中加入12 μl的PolyFect Reagent，进行上下重复颠倒，颠倒5次，进行混匀处理，在室温环境下进行静置，静置时间5～10 min，对转染复合物的形成起到促进作用，之后吸去置于六孔板中的培养基，将新鲜的完全培养基加入(3 ml)，在含有转染复合体的EP管中加入含有血清和双抗的600 μl完全培养基，行上下重复颠倒，颠倒2次，再次加入六孔板中，之后进行水平摇晃，以促进转染复合物的均匀分布。之后进行培养，培养24 h后进行常规的换液处理，再次继续24 h的培养，倒置，使用荧光显微镜下对荧光亮度进行观察，对细胞进行收集，提取细胞RNA，鉴定转染效率，将转染效率最高的质粒组、空载组稀释液接种于10 mm2培养皿中(PCR验证筛选)，将40 μl嘌呤霉素加入每孔后常规培养，在对其培养3 d后将培养皿中的培养液弃去，选取经过PCR验证筛选的细胞进行消化处理后稀释，稀释后接种在24孔板中，最终建立稳定转染的ALDH2过表达组、ALDH2沉默组。

1.2.54-HNE水平检测 采用酶联免疫吸附试验检测各组4-HNE水平。

1.2.6心肌细胞凋亡、心肌梗死面积 采用流式细胞仪检测，将各组细胞，转染质粒24 h后，将细胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化5 min至细胞瓶表面呈雾状，磷酸盐缓冲液(PBS)吹打下来，4℃ 2 000 r/min 3 min，PBS洗涤、离心、重悬2次，流式细胞仪分析细胞凋亡率。将大鼠心肌组织制作切片在1%的TTC溶液中，37℃孵化，每7～8 min翻动1次，染色15 min后使用生理盐水清洗，使用氯化三苯基四氮唑法(TTC)法检测大鼠心肌梗死面积。

1.2.7Western印迹检测JNK、ERK、p53蛋白表达 将采集到的细胞，研磨后加入蛋白缓冲液，进行常规蛋白提取，采取蛋白质定量法(BCA)进行定量分析。50 μg的蛋白样品上样后十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，通过蛋白电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脱脂奶粉TBST中进行避光封闭1 h，洗涤之后加入一抗稀释溶液(JNK、ERK、p53按照1∶1 000比例进行稀释)，在4℃的环境中过夜保存，洗涤后加入二抗稀释溶液(JNK、ERK、p53按照1∶5 000比例进行稀释)，在温床中孵育1 h后再次洗涤，加入电化学发光液，曝光2～3次，取重叠值。使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0统计软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1ALDH2抑制4-HNE对心肌梗死模型大鼠心功能的影响 与正常组相比，模型组、ALDH2过表达组、ALDH2沉默组LVDd、LVDs、LVPWD、IVSD水平升高，具有统计学差异(P<0.05)。与模型组相比，ALDH2过表达组、ALDH2沉默组LVDD、LVDS、LVPWD、IVSD水平显著降低(P<0.05)；与ALDH2沉默组相比，ALDH2过表达组LVDd、LVDs、LVPWD、IVSD水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组心功能水平、4-HNE水平及肌细胞凋亡情况比较

2.2各组大鼠病理组织观察 正常组心肌细胞细胞膜和细胞核保持完整，内质网正常，未见炎性细胞浸润。模型组心肌细胞发生皱缩，内质网表现为空泡化，细胞内部结构完全消失，染色质连接成波浪状。ALDH2沉默组内质网、线粒体肿胀，并且表现为空泡化；ALDH2过表达组心肌细胞结果得到显著的改善。见图1。

图1 各组病理组织观察(HE，×200)

2.3各组4-HNE水平比较 如表1所示，与正常组相比，模型组、ALDH2过表达组、ALDH2沉默组4-HNE水平升高，具有统计学差异(P<0.05)。与模型组相比，ALDH2过表达组、ALDH2沉默组4-HNE水平显著降低(P<0.05)；与ALDH2沉默组相比，ALDH2过表达组4-HNE水平显著降低(P<0.05)。

2.4ALDH2抑制4-HNE对心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡、心肌梗死面积的影响 如表1所示，与正常组相比，模型组、ALDH2过表达组、ALDH2沉默组心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积升高，具有统计学差异(P<0.05)。与模型组相比，ALDH2过表达组、ALDH2沉默组心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积显著降低(P<0.05)；与ALDH2沉默组相比，ALDH2过表达组心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积显著降低(P<0.05)。

2.5ALDH2抑制4-HNE对心肌梗死模型大鼠作用机制研究 如表2、图2所示，与正常组相比，模型组、ALDH2过表达组、ALDH2沉默组JNK、ERK蛋白表达升高，p53蛋白表达显著降低，具有统计学差异(P<0.05)。与模型组相比，ALDH2过表达组、ALDH2沉默组JNK、ERK蛋白表达显著降低，p53蛋白表达显著升高(P<0.05)；与ALDH2沉默组相比，ALDH2过表达组JNK、ERK蛋白表达显著降低，p53蛋白表达显著升高(P<0.05)。

表2 各组大鼠JNK、ERK、p53蛋白表达水平比较

图2 Western印迹检测JNK、ERK、p53蛋白表达

3 讨 论

目前心肌梗死发病相关机制尚未明确，临床中治疗心肌梗死的方式主要包括抗凝、抗血小板、溶栓以及心肌再灌注等治疗方式，虽然能够降低患者心肌梗死的面积，但是对患者的心肌也产生不同程度的损伤，患者出现的并发症较多，治疗效果不理想〔7,8〕。因此寻找合适的治疗手段对患者来说意义重大。

本研究结果说明ALDH2过表达能够改善大鼠心功能相关指标水平，促进大鼠心功能恢复。本文通过病理学观察，模型组大鼠心肌细胞发现有大量的炎性细胞浸润，并且局灶性梗死瘢痕大面积出现，心肌纤维也发生断裂，说明模型建立成功，与杨晓华等〔9〕研究结果保持一致。研究显示，在心肌梗死发生后机体中产生的氧自由基，对生物膜磷脂不饱和脂肪酸脂质发生过氧化作用，导致复杂产物及新自由基产生〔10,11〕。脂质过氧化反应过程中主要产生的物质是醛基产物，会增加自由基的稳定性，促进氧自由基向细胞中扩散，对细胞产生损伤。江玲等〔12〕研究指出，4-HNE能够对线粒体的活性产生破坏作用，造成线粒体发生线粒体功能障碍，导致细胞修复大分子损伤能力降低。因此抑制4-HNE水平，能够减缓心肌损伤程度，对心肌梗死患者来说至关重要。4-HNE属于一种较强的细胞毒素，能够抑制心肌收缩力。在动物实验研究中，4-HNE能够诱导心律失常，在心肌缺血发生后，会造成机体产生组织损伤〔13〕。本研究结果说明ALDH2过表达抑制4-HNE水平显著，降低心肌梗死后4-HNE产生，与Li等〔14〕研究结果一致。

ALDH2在4-HNE中发挥着酯酶和还原酶的作用，通过ALDH2能够降低4-HNE毒性，从而减轻对心肌的损伤〔15〕。研究指出，将低乙醛及4-HNE水平，有助于提高机体的抗氧化能力，对动脉粥样硬化的进程有缓解作用，从而降低心肌梗死的面积，避免心肌肥厚和收缩功能障碍产生〔16,17〕。本研究结果说明ALDH2过表达能够减少心肌细胞凋亡及减少心肌梗死面积。p53是一种凋亡诱导蛋白，在4-HNE诱导心肌细胞凋亡过程中发挥着重要作用。ERK和JNK属于重要的丝裂原活化蛋白激酶，在细胞活动中发挥着重要作用，通过活化ERK和JNK能够将p53激活，对p53蛋白表达起到上调作用〔18,19〕。本文结果说明ALDH2过表达能够下调JNK、ERK蛋白表达，上调p53蛋白表达。Yang等〔20〕研究也显示，采用4-HNE刺激大鼠心肌细胞发现，JNK、ERK活化，表达升高，本研究与其研究一致。

综上所述，过表达ALDH2能够抑制4-HNE水平，改善心肌梗死大鼠心功能状况，通过调控JNK、ERK、p53相关蛋白，能够抑制心肌细胞凋亡,为其临床治疗提供新的治疗思路。