树型金银花与野生金银花HPLC指纹图谱对比研究

邓寒霜，李筱玲，赵月梅，王新军，杨文怡，贺 博，潘月娜

(1 商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000；2 陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院,陕西 商洛 726000；3 贵州师范学院 生物科学学院,贵州 贵阳 550018；4 陕西天士力植物药业有限公司,陕西 商洛 726000)

金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或初开的花[1]，具有解毒清热、疏散风热之功效，可用于温病发热、风热感冒等证[2]。金银花中主要含有黄酮、挥发油、有机酸及三萜类成分[3-5]，《中国药典》(2015年版)以绿原酸、木犀草苷为指标性成分控制金银花药材质量。现代药理研究表明，金银花具有抑菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤、保肝等作用[6-8]。金银花药用历史悠久，为大宗常用药材，同时又是一种健康的药食两用植物，市场需求量大[9-11]。金银花的抗病毒作用在治疗“非典”和“新冠”肺炎中得到了很好应用，以其为主要原料药的“双黄连”“连花清温胶囊”等中成药的热销，带动了金银花市场需求的进一步增长[12-15]。

陕西省商洛市位于秦岭南麓东段，地跨长江、黄河两个流域，南北气候分界线从市内穿境而过，北部属暖温带、南部属北亚热带气候，地质、气候条件的多样性造就了商洛丰富的药用植物资源。商洛药材种植历史悠久，是金银花的主产区之一，年产金银花在100～500 t。然而传统藤本金银花产量低、采摘费工且适宜采收期短，药农种植积极性不高。树型金银花是传统金银花经人工选育改良的栽培品种，其花蕾大、花针长、花瓣厚，产量高，植株生长快，花枝短，采收省时省工，深受药农青睐[16]。2012年以来，树型金银花开始在商洛丹凤、洛南等地规模化引种种植。

中药及其制剂均为多组分复杂体系，仅用少数几种指标性成分难以全面准确地评价中药质量。中药HPLC指纹图谱是一种综合的、可量化的中药质量控制技术。HPLC指纹图谱能够提供丰富的鉴别信息，较为全面地反映中药化学成分的种类与数量，符合中医药整体观理念，可对药品质量进行客观、整体、综合的评价，进而确保中药质量的可控性和稳定性。世界卫生组织已将指纹图谱技术作为中草药评价的主要技术[17]。本研究对栽培于陕西商洛、安康等地的13份树型金银花样品，以及采自商洛市和毗邻的河南省部分地区的12份野生金银花样品进行分析，构建2种不同金银花的HPLC指纹图谱，通过聚类分析，初步探明不同地区、品种间金银花的关系，以期为后期快速鉴定金银花品种、评价金银花质量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用13份树型金银花样品收集自陕西商洛、安康等地的金银花种植基地；12份野生金银花样品采自陕西洛南、丹凤以及河南省灵宝市等地。全部样品经商洛学院生物医药与食品工程学院李筱玲执业药师鉴定为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾，各样品来源详细信息见表1。

表1 供试2种金银花样品来源信息Table 1 Source information of two kinds of honeysuckle samples

绿原酸、异绿原酸、木犀草苷标准品,均购自北京世纪奥科生物技术有限公司(定量分析用，20 mg)。高效液相色谱仪，岛津LC-20A型(四元泵、在线脱气机、自动进样品、柱温箱、PDA检测器)。

1.2 样品溶液的制备

1.2.1 供试品溶液 取金银花干燥样品适量，粉碎，过3号药典筛(24目，筛孔内径355 μm±13 μm)。精密称取金银花样品粉末0.5 g，置具塞平底烧瓶中，加入体积分数50%乙醇25 mL，称质量，超声(40 kHz，250 W)提取30 min，冷却，再次称质量，以体积分数50%乙醇补足原质量，即得供试品溶液。0.45 μm微孔滤膜过滤，备用[18]。

1.2.2 混合对照品溶液 分别取绿原酸、异绿原酸、木犀草苷标准品适量，精密称质量，置10 mL容量瓶中，以体积分数50%乙醇溶解并定容至刻度，即得绿原酸0.50 mg/mL、异绿原酸0.43 mg/mL、木犀草苷0.26 mg/mL的混合对照品溶液。0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3 HPLC分析

Hypersil Gold C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流动相：甲醇(A)、体积分数0.1%磷酸(B)，按表2所示程序进行梯度洗脱；检测波长270 nm，进样量10 μL，柱温 30 ℃。在该色谱条件下，样品各组分可获得良好分离。

表2 金银花样品HPLC分析梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution procedure for HPLC analysis of honeysuckle

1.4 指纹图谱分析

取供试品溶液适量进行HPLC检测，记录55 min内的色谱图。将AIA格式的HPLC分析数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)”进行分析处理。选择峰面积较大、稳定、分离度好、干扰少的绿原酸色谱峰为参照峰，以其保留时间和峰面积为参照，计算其他各组分色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，采用中位数法进行多点校正，分别建立树型金银花、野生金银花的对照指纹图谱，计算各批次样品之间，以及各样品与对照指纹图谱间的相似度S。具体计算方法见文献[17,19]。

1.5 方法学考察

1.5.1 基线考察 取体积分数50%乙醇适量，0.45 μm微孔滤膜过滤后精密吸取10 μL，进样，按1.3节色谱条件分析，记录色谱数据，作为阴性对照。

1.5.2 精密度考察 取同一供试品溶液连续进样10次，记录色谱数据，比较各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)，考察所用仪器的精密度。

1.5.3 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别在制备后0，4，8，12，24 h进样，比较各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积和相对峰面积的RSD，考察该样品溶液的稳定性。

1.5.4 重复性考察 取同一金银花样品，平行处理成10份供试品溶液，进样，记录色谱数据，比较各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积和相对峰面积的RSD，考察供试品制备方法的重现性。

1.5.5 验证试验 另行收集部分金银花样品，按1.4节的方法建立指纹图谱，以研究所得2种金银花HPLC对照指纹图谱为对照计算相似度，对研究结果进行验证。

1.6 聚类分析

以共有峰的相对峰面积为评价指标，利用SPSS 13.0软件，采用离差平方和法分别对2种金银花样品进行聚类分析。

1.7 有效成分含量测定

取供试品溶液适量，按1.3节条件进行HPLC分析，以绿原酸、异绿原酸、木犀草苷标准品为对照，采用外标法，对2种金银花各样品中的上述3种成分含量进行测定。

2 结果与分析

2.1 2种金银花HPLC指纹图谱的建立

利用2种金银花各样品HPLC数据建立其对照指纹图谱。树型金银花各样品指纹图谱中，峰面积达10 000以上的共有峰为13个；野生金银花各样品指纹图谱中，峰面积达10 000以上的共有峰为28个。各样品指纹图谱、对照指纹图谱、混合对照品色谱图见图1，各样品共有峰检测和相似度计算结果见表3～5。

由图1和表3可知，相较于树型金银花，野生金银花的HPLC指纹图谱更复杂，共有峰数目更多，约为树型金银花的2.2倍。表明野生金银花中含有更多的化学成分，提示其药理作用可能与栽培品种有别。

表3 2种金银花指纹图谱的共有峰匹配结果Table 3 Matching of common peaks in fingerprints of two varieties of honeysuckle

a.树型金银花对照指纹图谱；b.13批树型金银花样品指纹图谱；c.野生金银花对照指纹图谱；d.12批野生金银花指纹图谱；e.混合对照品色谱图；f.阴性对照色谱图；1.绿原酸；2.异绿原酸；3.木犀草苷a.Comparative fingerprint of tree type honeysuckle;b.Fingerprint of 13 tree type honeysuckle samples;c.Comparative fingerprint of wild honeysuckle;d.Fingerprint of 12 wild honeysuckle;e.Chromatogram of mixed reference substance;f.Negative control;1.Chlorogenic acid;2.Isochlorogenic acid;3.Luteolin

由表4可知，12份野生金银花样品中有10份样品与对照指纹图谱的相似度在0.95以上；由表5可知，13份树型金银花样品中有12份与对照指纹图谱的相似度在0.95以上，表明2种金银花的对照指纹图谱可以准确描述各自品种的HPLC特征；有24份样品与对照指纹图谱相似度达0.90以上。同时，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)”计算得2种金银花对照指纹图谱间的相似度仅为0.329，表明本研究所得金银花对照指纹图谱具有良好的辨识度，可用于金银花品种的快速区分。

表4 12份野生金银花指纹图谱的相似度计算结果Table 4 Similarity calculation results of fingerprint of wild honeysuckle

表5 13份树型金银花指纹图谱的相似度计算结果Table 5 Similarity calculation of fingerprint of tree type honeysuckle

由表4和表5数据计算可得，野生金银花各样品间的相似度平均值为0.936，RSD为5.27%；树型金银花各样品间的相似度平均值为0.950，RSD为3.74%，由此可知，树型金银花指纹图谱稳定性较野生金银花好。说明作为栽培品种的树型金银花，在统一规范的人工栽培条件下，其品质较野生金银花稳定，更符合药品质量稳定性、均一性的要求。

2.2 金银花色谱测定方法学考察结果

由图1可知，在本研究试验条件下所得色谱图的基线平稳，对样品分析无干扰。精密度、稳定性、重复性考察试验结果所得RSD值均<1.00%，表明本研究所用仪器精密度高，样品溶液制备方法重复性好，在24 h内具有良好的稳定性。

另行收集树型金银花样品12份，野生金银花样品5份，对研究结果进行验证，具体结果见表6 。由表6可知，1～12号验证试验用样品与树型金银花对照指纹图谱间的相似度在0.934～0.997，与野生金银花对照指纹图谱间的相似度均<0.4，表明此部分样品为树型金银花；13～17号验证样品与野生金银花对照指纹图谱间相似度在0.908～0.987，同时与树型金银花对照指纹图谱间的相似度均在0.65以下，表明这5份样品为野生金银花。2种金银花类型的鉴别结果与样品提供者所提供信息一致，证明本研究所得对照指纹图谱可快速区别2种金银花。

表6 2种金银花对照指纹图谱验证试验结果Table 6 Verification of two kinds of honeysuckle control fingerprints

2.3 2种金银花的聚类分析结果

根据树型金银花及野生金银花HPLC指纹图谱数据进行聚类分析，结果如图2所示。由图2可知，12份野生金银花样品可分为4个分支，其中洛南石坡、洛南巡检、洛南灵口、洛南景村4地样品(Y1～Y4)聚为一支，河南灵宝的2份样品(Y11和Y12)为一支，丹凤铁峪铺、丹凤武关、丹凤蔡川、丹凤留仙坪4地样品(Y5～Y8)为一支，丹凤花瓶子、丹凤竹林关2地样品(Y9和Y10)为一支。树型金银花样品也可分成4个分支，其中洛南景村(S3)、安康樊坡(S13)、安康大河镇(S10)、安康构元(S12)、洛南寺坡(S6)、汉中大河坝(S8)、丹凤武关(S2)、丹凤铁峪铺(S9)、丹凤花瓶子(S7)、丹凤竹林关(S5)等来自陕南各地的样品为一支；渭南蒲城(S4)、西安鄠邑(S11)、河南灵宝(S1)3地各为1支。

Y1～Y12,S1～S13所示样品与表1同Y1-Y12,S1-S13 samples are the same as Table 1图2 金银花样品聚类分析结果Fig.2 Cluster analysis of honeysuckle samples

聚类结果表明，野生金银花品质与产地密切相关，产于同一县区的样品基本上归为一类，其中丹凤县花瓶子、竹林关较其他几个产地更为偏南，因此与其他样品差异更大。树型金银花中，产于陕南各地的10个样品差异不大，基本上归为一类；产于渭南蒲城、西安鄠邑、河南灵宝3地样品差异较大，特别是产于河南灵宝样品与陕西各地样品均存在较大差异，可单独为一类。究其原因应是，树型金银花样品均采自人工种植基地，在环境、气候条件差异不大的陕南地区，以统一、规范人工技术栽培而成的药材，其品质具有良好的稳定性。而另外3个样品，因为环境、气候、种植技术等因素差异，造成样品差异较大。

2.4 2种金银花中有效成分含量

2种金银花中的有效成分含量测定结果见表7。由表7可知，野生金银花样品中的绿原酸、异绿原酸、木犀草苷3种成分平均含量分别为3.72%，0.39%，0.15%；树型金银花样品分别为3.42%，1.22%，0.06%。不同产地的野生金银花有效成分含量存在明显差异，其RSD值在75%以上，表明环境因素对野生金银花品质影响较大。其中来自商洛市洛南县的4个样品含量较为接近，且均明显高于《中国药典》(2015年版)中金银花“绿原酸不得少于1.5%，木犀草苷不得少于0.05%”的要求。说明洛南县为野生金银花适宜生长区，产于该县的野生金银花品质优良。13份树型金银花有效成分含量相对较为稳定，进一步说明规范化种植有助于保证药材品质的一致性。

表7 2种金银花样品中有效成分含量测定结果Table 7 Determination of effective components in honeysuckle samples %

3 讨 论

近年来，金银花药材及以其为主要原料药的中药成方制剂的指纹图谱研究工作取得了良好进展：丁洁等[13]对金银花多糖的指纹图谱及体外抗病毒活性进行了研究，陈梓媛等[20]运用指纹图谱技术建立了金银花配方颗粒质量的快速检测方法；范毅等[18]确立了可准确评价药材质量的金银花提取物指纹图谱，标定共有峰12个，该方法需通过前处理制备金银花药材提取物；刘天亮等[21]基于中药质量标志物技术提出了金银花指纹图谱体系构建的新思路。近年来，树型金银花特别是其新品种“金花3号”，因花期长、产量高等优点，种植面积逐年增加[22-23]。本研究利用HPLC指纹图谱技术对树型金银花与野生传统藤本金银花进行了对比分析，建立了2个品种的对照指纹图谱。与现有文献方法相比，本研究建立了一种快速鉴别2种金银花类型的新方法，且样品溶液制备方法更简便，指纹图谱共有峰更多。

本研究结果表明，2种金银花品种全部25份样品中，有24个样品与各自对照指纹图谱的相似度在0.90以上，2种金银花对照指纹图谱间的相似度仅为0.329。从聚类分析结果可以发现，产于陕南的树型金银花与来自关中及河南等地的树型金银花具有一定的区别。通过验证试验证明，本研究所得对照指纹图谱具有很好的辨识度，可以用来快速区分树型金银花与野生传统藤本金银花。

从本研究所得HPLC指纹图谱及共有峰数据可以看出，野生金银花中化学成分更丰富，含某些树型金银花中未有之化学物质。同时有些野生金银花中的有效成分含量明显高于树型金银花，表明野生金银花可能具有某些树型金银花不具备的药理作用。这将是本课题组后续研究的方向和重点。此外，不同产地野生金银花的指纹图谱相似度、有效成分含量、聚类分析结果均存在较大差异，表明野生金银花质量易受环境、气候因素影响，品质不稳定；某些产地药材含量极高，某些药材又达不到药典标准，造成以之为原料的中成药质量不稳定，不符合药品质量控制要求，不利于中药产业发展，这种不确定性也会为临床用药带来隐患。与野生金银花相比，树型金银花指纹图谱相似度更高、有效成分含量更稳定。聚类分析结果也表明，产于气候类型、环境条件类似的陕南地区的树型金银花性质接近，质量非常稳定，更符合药品质量稳定性、均一性的要求。研究结果进一步证明,规范化种植有助于确保药材质量的一致性和稳定性，且商洛市洛南县为金银花适生区，产于该县的野生金银花品质优良。当地政府应在该县加强引导，引入良种，再辅以有效的技术指导，以促进当地中药材产业发展。