外源褪黑素对干旱胁迫小麦发芽及幼苗生理特性的影响

李红叶,翟秀珍,张少聪,申佳明,杨 娜,李浩然,付晓艺,2,李瑞奇,李东晓

(1 河北农业大学 农学院,省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室 河北省作物生长调控实验室，河北 保定 071001；2 石家庄市农林科学研究院，河北 石家庄 050041)

小麦(TriticumaestivumL.)是我国北方重要的粮食作物。随着人口持续增加，保证小麦产量稳定对我国经济和社会发展具有重要作用。华北地区作为我国冬小麦重要产区之一，水资源严重短缺，人均水资源占有量很少[1]。尤其近几年，极端天气频发，导致出现严重干旱现象，水资源供需矛盾进一步凸显[2]。非生物胁迫是作物限产的重要因素，而干旱胁迫是主要因素之一。干旱胁迫影响了小麦的正常生长发育，降低了叶片叶绿素含量、净光合速率及PSⅡ最大光化学效率，导致过氧化氢(H2O2)与丙二醛(MDA)积累增加及抗氧化酶活性降低[3-4]；通过ABA可以调控气孔导度，进而影响水分利用和小麦产量[5]。因此，研究干旱胁迫对小麦生长发育、生理状况的影响，挖掘小麦的生产潜力，是进一步提高华北地区小麦总产量、缓解水资源短缺和粮食压力矛盾的主要途径，对于保障中国粮食安全具有重要意义。

褪黑素(MT，化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺)是一种广泛存在于动植物体内的信号分子，是抗氧化作用很强的内源性自由基清除剂[6]。近年来研究表明，褪黑素在提高绿色植物抗逆能力以及抗水分胁迫、延缓衰老等非生物胁迫方面具有积极作用。褪黑素可通过提高活性氧清除酶活性以及抗氧化物质的含量来减少H2O2、脯氨酸和MDA的积累，减轻干旱胁迫引起的氧化伤害，从而达到增强植物对干旱的抵御能力[7]；通过增加根冠比及内源ABA和MT水平，促进水分吸收，维持细胞膨压和植株持水能力[8-10]；外施褪黑素有利于延迟干旱胁迫下黑麦草叶片的衰老，并维持较高的叶绿素含量，提高其光合能力[11]；增加谷胱甘肽、抗坏血酸含量及其基因表达，从而提高小麦幼苗干旱下的生长恢复能力[9]。褪黑素对植物抗逆能力的效应还受其用量和作物种类的影响[12]：1 μmol/L或10 μmol/L褪黑素可消除铜离子对紫甘蓝鲜质量的抑制，而100 μmol/L褪黑素增强铜离子对种子萌发和幼苗生长的抑制[13]；0.8 mmol/L褪黑素显著促进盐胁迫下玉米种子发芽，提高渗透物质含量[14]；0.05 mmol/L褪黑素可以促进干旱胁迫下油菜生长，降低过氧化氢含量，增强抗氧化酶活性[15]；0.5 mmol/L褪黑素可增强田间小麦苗期的耐旱能力，降低膜伤害，保护叶绿体基粒片层完整，提高叶片净光合速率，维持细胞膨压和植株持水能力[9]。

小麦品种具有地域性，目前在华北地区有关褪黑素影响不同小麦品种抗旱生理的研究报道较少。本试验立足于华北地区水资源缺乏的环境，旨在通过研究适于该地区种植的不同抗旱小麦品种外施褪黑素后的发芽状况，明确抗旱效应明显的褪黑素浓度，分析该浓度褪黑素对小麦幼苗抗旱生理的影响，进一步明确褪黑素在不同小麦品种苗期抗干旱胁迫过程中的调节作用，以期为华北地区小麦早期抗旱锻炼及节水增产栽培提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦品种济麦22由山东省农业科学院提供，为广适性高产品种，抗旱性一般；衡观35由河北省农林科学院旱作农业研究所选育，为抗旱节水、高产型品种。褪黑素购自SIGMA公司。

1.2 试验设计

1.2.1 发芽试验 本试验于2018年3月-2018年12月在河北农业大学人工气候室进行。选取饱满、大小一致的小麦种子，经体积分数75%酒精消毒后，用蒸馏水清洗4～5次，置于铺有两层滤纸的发芽盒中，每盒50粒。分别设置：对照(CK)、20% PEG(PEG)、20% PEG+10 μmol/L 褪黑素(T-10)、20% PEG+100 μmol/L 褪黑素(T-100)、20% PEG+300 μmol/L 褪黑素(T-300)，共5个处理，重复3次。其中，对照处理的发芽盒滤纸使用蒸馏水浸湿；PEG处理的滤纸用20% PEG溶液(质量体积比)浸湿；褪黑素处理的滤纸则用20%PEG+各浓度褪黑素溶液(用少量无水乙醇溶解相应质量的褪黑素粉末，再用20% PEG溶液稀释至相应浓度)浸湿。将发芽盒置于培养箱培养7 d，培养箱条件设置温度为22 ℃，相对湿度为63%。

1.2.2 水培试验 根据发芽状况，选择有明显改善PEG胁迫的褪黑素浓度，在人工气候室进行幼苗水培处理。在穴盘上利用蛭石进行种子萌发，长至一叶一心时转入Hoagland营养液的培养箱中，生长条件设置：温度为22 ℃，相对湿度为63%，光12 h/暗12 h，缓苗5～7 d。待长至2～3叶时，重新配置Hoagland营养液(CK)、20% PEG(PEG)、20% PEG+300 μmol/L 褪黑素 (T-300)溶液，并将2个小麦品种幼苗分别进行CK、20% PEG、T-300处理。重复3次，处理时长为12 h。处理完毕，选取代表性植株，测量叶片光合参数、荧光参数；之后分别将叶和根部剪碎、混匀，每份称0.5 g，用锡箔纸包裹，液氮快速冷冻后，置于-80 ℃低温保存，备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 发芽指标测定 小麦种子萌发后1～7 d，每天统计发芽籽粒数；萌发后3 d计算发芽势；萌发后7 d计算发芽率、发芽指数和活力指数[16]。

发芽势=3 d内发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽率=7 d内发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)；

活力指数=GI×S。

式中：Gt为时间t的发芽数，Dt为相应的发芽时间，S为发芽结束时单株幼苗干质量(g)。

培养7 d后，统计萌发籽粒的胚芽长、胚根长，以胚芽伸出胚芽鞘1.5 cm作为统计标准，每个处理统计3次，以尺子测量；胚根数则采用人工计数。发芽结束时用滤纸沥干幼苗表面水分后称鲜质量，再转移至60 ℃烘箱烘干至恒质量称干质量，计算幼苗含水量。幼苗含水量=(幼苗鲜质量-幼苗干质量)/幼苗鲜质量×100%。

1.3.2 光合参数测定 由于小麦幼苗叶片较窄，使用光合仪(Li-6400，Li-Cor Inc.,Lincoln,NE,USA)测定时，设内置光源1 500 μmol/(m2·s)，选择代表植株顶部展开的活体叶片，使叶片长度充满叶室，手动测量叶片宽度，计算叶面积，然后输入叶面积自动获得净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)。按下式计算瞬时水分利用效率(WUEins)[17]。

WUEins=Pn/Tr。

1.3.3 叶绿素荧光参数测定 选择代表性植株顶部展开的活体叶片，使用荧光仪( FMS-2，Hansatech，英国)测定叶绿素荧光参数，并计算叶片的最大光化学效率(Fv/Fm)、表观光合电子传递速率(ETR)。

1.3.4 抗氧化酶活性测定 取0.5 g新鲜叶片样品，置于预冷的研钵中，加入1 mL磷酸缓冲液(0.05 mol/L,pH 7.8)研磨呈匀浆，转入冷冻离心机(4 ℃，12 000g)，离心20 min，取上清液备用。SOD活性测定采用氮蓝四唑法，POD活性测定采用愈创木酚比色法，过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外分光光度计法[18]。

1.3.5 生理指标测定 MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法[18]；脯氨酸含量测定采用磺基水杨酸法；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法；根系活力测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法[19]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据，SPSS 23.0软件中利用Duncan单因素方差分析在0.05水平上进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对小麦种子发芽的影响

由表1可知，与对照(CK)相比， PEG处理显著降低济麦22和衡观35的发芽势、发芽指数、幼苗干质量、活力指数，其中济麦22的发芽势、发芽指数、幼苗干质量、活力指数分别降低70.0%，57.6%，43.5%和76.4%；衡观35分别降低8.7%，15.3%，39.7%和49.4%。PEG处理显著降低济麦22发芽率，降幅为6.7%；对衡观35的发芽率影响并不显著。施加不同浓度的褪黑素后，与PEG处理相比，T-10进一步降低了两个小麦品种的发芽率和发芽指数。与PEG处理相比，T-100显著增加了PEG胁迫下济麦22的发芽势、发芽指数和活力指数，增幅分别为130%，25.2%和52.9%；显著增加了衡观35的幼苗干质量和活力指数，增幅分别为26.6%和35.9%。T-300处理下，济麦22的发芽势、发芽率、幼苗干质量均恢复至对照水平，尽管发芽指数和活力指数仍显著低于对照，但降幅分别减少至11.7%和15.3%；衡观35的发芽势、发芽率、发芽指数、幼苗干质量、活力指数均与对照无显著差异。

表1 PEG及褪黑素处理对不同品种小麦种子发芽的影响Table 1 Effect of PEG and melatonin treatments on seed germination of different wheat varieties

2.2 褪黑素对小麦种子形态指标及幼苗含水量的影响

由表2可见，与对照(CK)相比，PEG处理显著降低了济麦22胚芽长、胚根长和幼苗含水量，降幅分别为83.69%，71.51%和29.42；胚根数无显著变化。与PEG处理相比，T-10处理进一步降低了济麦22的胚芽长、胚根长和胚根数，降幅分别为35.19%，42.18%和44.95%。与PEG处理相比，T-100处理下济麦22的胚芽长显著增加，增幅为1.16倍；胚根长、胚根数和幼苗含水量均有所增加，但不显著。T-300处理的胚芽长、胚根长和幼苗含水量均比PEG处理显著增加，增幅分别为3.15倍、1.36倍和20.65%，但显著低于对照。

表2 PEG及褪黑素处理对不同品种小麦形态指标及幼苗含水量的影响Table 2 Effects of PEG and melatonin treatments on morphological index and water content of seedlings of different wheat varieties

由表2还可以看出，与CK相比，PEG处理显著降低了衡观35胚芽长、胚根长和幼苗含水量，降幅分别为79.38%，66.28%和20.51%；胚根数显著增加，增幅为6.58%。与PEG处理相比，T-10处理下衡观35的胚芽长、胚根长、胚根数、幼苗含水量均无显著性变化。T-100处理胚芽长、胚根长均比PEG处理显著增加，增幅分别为1.44倍和87.74%；但均显著低于对照，比对照减少了49.60%和36.70%；胚根数显著高于对照，增幅为7.31%。T-300处理的胚芽长、胚根长、幼苗含水量均比PEG处理显著增加，增幅为2.69倍、1.35倍和12.79%；但仍显著低于对照，比对照降低了23.84%，20.72%和8.86%；胚根数显著高于对照，增幅为6.58%。

2.3 褪黑素对小麦幼苗叶片光合生理和水分利用效率的影响

选用明显促进发芽的褪黑素浓度处理(T-300)，进一步观察其对小麦幼苗抗旱生理的影响。图1显示，PEG处理显著降低了两个品种小麦幼苗叶片的净光合速率；施加褪黑素(T-300处理)后，济麦22幼苗叶片的净光合速率显著提高到对照水平，衡观35幼苗叶片的净光合速率比PEG处理提高了10.69%，但未恢复至对照水平。两个品种蒸腾速率变化趋势一致：PEG胁迫显著降低小麦幼苗叶片蒸腾速率，褪黑素处理后蒸腾速率显著提高，但未恢复至对照水平，且衡观35幼苗叶片的蒸腾速率在各处理下均显著低于济麦22。两个品种气孔导度在PEG胁迫下呈降低趋势，其中济麦22降低显著，衡观35降低不显著；施加褪黑素后，无明显变化。两个品种小麦幼苗叶片瞬时水分利用效率受PEG胁迫后呈上升趋势，衡观35在T-300处理下瞬时水分利用效率显著高于对照；此外，衡观35的水分利用效率在各处理下均显著高于济麦22，说明不同小麦品种的抗旱性存在差异。

图1 PEG及褪黑素对不同品种小麦幼苗叶片光合生理和水分利用效率的影响Fig.1 Effects of melatonin on photosynthetic physiology and water use efficiency of seedlings of different wheat varieties under PEG treatment

2.4 褪黑素对小麦幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

由表3可知，与对照CK相比，PEG处理显著降低了济麦22光反应下Fs、Fm′，显著降低了暗反应下Fo、Fm、Fv，但显著增加了Fv/Fm。T-300处理与PEG处理的变化趋势相同，且二者之间无显著性差异。PSⅡ和ETR在3个处理间无显著性变化。

表3 PEG及褪黑素对不同品种小麦幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响Table 3 Effects of leaf fluorescence parameter of seedlings of different wheat varieties under PEG and melatonin treatments

对于衡观35而言，与CK相比，PEG处理显著降低了光反应下的Fm′，其他指标无显著性变化。与PEG处理相比，T-300处理则显著提高了叶片光反应下的Fm′，与对照无显著性差异；与CK相比，T-300处理显著降低了暗反应下的Fo，其他指标均无显著性变化。

2.5 褪黑素对小麦幼苗叶片抗氧化生理的影响

由表4可见，与CK相比，PEG处理显著增加了济麦22幼苗叶片丙二醛(MDA)含量；而褪黑素处理显著降低了MDA含量，且与CK间无显著差异。衡观35作为抗旱品种，在PEG胁迫下MDA含量无显著变化；施加褪黑素处理也未显著改变MDA含量。在抗氧化方面：PEG处理导致济麦22幼苗叶片SOD活性有下降趋势,而T-300处理后SOD活性显著高于PEG处理，达到对照水平；衡观35幼苗叶片SOD活性在PEG胁迫下显著增加，且施加褪黑素后SOD活性进一步显著增加，显著高于对照和PEG处理。与CK相比，PEG处理下济麦22 POD活性呈上升趋势，但不显著，T-300处理的POD活性显著低于PEG处理，且与对照无显著差异；衡观35的POD活性在不同处理间无显著差异。此外，济麦22的POD活性显著高于衡观35，说明不同抗旱小麦品种的差异性。CAT活性在济麦22中无显著变化，可能与叶片早期生长有关；在衡观35中表现为， PEG胁迫和T-300处理下均显著降低，二者之间无显著性差异。

表4 PEG及褪黑素对不同品种小麦幼苗叶片MDA含量及抗氧化酶活性的影响Table 4 Effects of antioxidase activity and MDA content in seeding leaf of different wheat varieties under PEG and melatonin treatments

2.6 褪黑素对小麦幼苗叶片渗透调节物质含量及根系活力的影响

由表5可见，与CK相比，PEG处理济麦22和衡观35幼苗叶片可溶性蛋白含量均无显著变化；而T-300下，济麦22叶片可溶性蛋白含量显著升高，衡观35变化不显著。济麦22幼苗叶片可溶性糖含量显著增加，施加褪黑素处理后降至对照水平；与此相反，衡观35可溶性糖含量在PEG胁迫下显著下降，施加褪黑素后增至对照水平。两个小麦品种幼苗叶片脯氨酸含量在PEG胁迫下均显著增加；施加褪黑素后，衡观35脯氨酸含量降至对照水平，而济麦22仍维持较高水平，显著高于对照。济麦22根系活力在PEG处理下无显著变化，而在T-300处理下显著提高；衡观35根系活力在PEG处理下显著降低，而在T-300处理下则显著提高，甚至显著高于对照。

3 讨 论

发芽率反映了种子发芽能力，胚芽长反映了小麦后期出苗分蘖健壮程度。研究表明，外施褪黑素在提高干旱胁迫下小麦种子发芽和幼苗生长方面有重要作用[9,20]。本试验中，PEG诱导干旱胁迫下，两个小麦品种种子的发芽指标、胚芽长、胚根长及幼苗含水量均显著降低，施加褪黑素后干旱胁迫症状有不同程度恢复。由于品种抗旱性差异，小麦种子发芽率的降低幅度及施加褪黑素后的恢复速度均不同，其中济麦22发芽指标在PEG胁迫下降幅在43.5%以上，而抗旱品种衡观35在PEG 胁迫下发芽指标的降幅控制在49.4%内。褪黑素浓度不同，调控效应也明显不同[9,15,21]。T-100和T-300褪黑素能明显改善PEG胁迫下小麦发芽状况，尤其T-300褪黑素使干旱胁迫下的发芽势、发芽率、幼苗干质量等恢复至对照水平，可显著提高PEG胁迫下的幼苗含水量，这与李本峰等[22]研究的褪黑素促进黑麦草种子发芽和生长试验结果基本一致。而T-300褪黑素处理下幼苗含水量的保持可能是发芽率改善提高的基础，因此选择该浓度进一步研究两个小麦品种幼苗的抗旱生理。与Posmyk等[13]研究不同的是，T-10处理进一步降低了两个小麦品种干旱下发芽率和发芽指数，这是由于不同浓度褪黑素可直接或间接影响植株体内的激素含量，且因作物类别不同，褪黑素的响应敏感程度有差异，导致影响植株的生长作用也不同[23-24]。

干旱胁迫下植株可以通过加强根系吸水能力和改变生理形态保证自身生长发育需求，根系吸水能力与根长、根数及根系活力密不可分。马富举等[31]指出耐旱型小麦品种可以通过提高根系活力、保持较高的根系生长量来增加根系吸收面积和植株吸水能力。本研究表明，外施褪黑素一方面能使根数完全恢复甚至超过对照，但另一方面侧根生长会受到抑制，这与褪黑素对葡萄[32]和蒺藜苜蓿[33]根系调控效应一致。叶君等[8]研究指出，褪黑素处理在干旱胁迫下可增加小麦幼苗的根冠比，进而促进根系吸水能力，改善植物组织水分状态。本研究结果表明，褪黑素显著提高两个小麦品种的根系活力，说明外施褪黑素会通过增加根数和提高根系活力减缓干旱的抑制效应，保持较高吸水能力。但值得注意的是，干旱胁迫下衡观35根系活力显著下降，济麦22无显著变化，这可能是由于衡观35在干旱胁迫下根系主动关闭或减弱部分功能，以降低对水分的需求[34]。

植株受干旱胁迫达到一定程度，体内生理平衡受到干扰，植株细胞膜容易发生膜脂过氧化，并产生大量活性氧自由基，从而抑制细胞的正常功能[35-36]。施加褪黑素可以诱导干旱胁迫下植株抗氧化能力的提高、增强对细胞膜的保护作用[37-38]。本试验结果表明，褪黑素处理显著降低了PEG处理下济麦22叶片MDA含量，而对衡观35影响不显著，说明褪黑素对不抗旱小麦品种膜脂过氧化的改善效应较明显。同时，褪黑素处理增强干旱胁迫下两个小麦品种幼苗叶片SOD活性，表明前期干旱胁迫下SOD发挥主要作用；但抑制济麦22 POD活性，这可能与POD活性在幼嫩组织中表现较弱，随着发育推进而逐渐变强有关；也可能与褪黑素的处理时长有关[8]。植株的抗氧化能力还与渗透调节功能相关，PEG胁迫下小麦可溶性蛋白含量呈上升趋势，与脯氨酸含量呈负相关，对植株自身的抗氧化防御系统起到了良好作用，使活性氧(ROS)含量维持在较低水平[39-41]。随着可溶性糖含量的增加，植物在逆境下失水的可能性越低[42]。本研究显示，施加褪黑素处理后两个小麦品种渗透物质的变化规律并不一致：济麦22可溶性蛋白含量增加，可溶性糖降至对照水平，脯氨酸含量保持较高水平；衡观35可溶性糖含量显著提高。这说明，一方面衡观35为抗旱节水型品种，与广适性的济麦22相比，在调控植株水分平衡、抵抗干旱能力方面有优越之处；另一方面外施褪黑素处理使两者均恢复至对照水平，或保持较高渗透物质水平的抗旱调控途径并不相同。

4 结 论

300 μmol/L 褪黑素为明显改善干旱胁迫下小麦籽粒发芽的有效浓度，可通过增加胚根数和胚根长保证吸水能力，增加幼苗含水量和幼苗干质量。褪黑素可降低干旱胁迫下小麦叶片气孔导度和蒸腾速率，以提高光合速率和水分利用效率，提高SOD活性和根系活力；但渗透调控机理不同：衡观35具有较强的抗旱性和水分利用效率，主要增加了可溶性糖含量；济麦22则主要增加了可溶性蛋白含量，并保持较高的脯氨酸含量。在生产上应根据品种特性，选择适宜浓度褪黑素，明确生理调控效果以增强小麦苗期抗旱性及后期个体生产力。