茵陈蒿精油化学成分及抑菌活性研究

冯升来，马稳霞，赵云花，涂艺馨，杨彩云，令利军，王 楠，陈学林

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

精油是从植物的果实、叶、花和根中提取的挥发性液体，属于植物的次生代谢产物[1]。植物精油具有很强的抗菌[2]、抗氧化[3]和杀虫[4]等活性，对果蔬中常见微生物有较强的杀菌效果，主要通过破坏微生物的细胞膜和细胞壁来影响基因表达、细胞呼吸作用和能量代谢等途径，进而抑制病原菌生长甚至导致其死亡[5]。植物精油常用于抗氧化、消炎抗菌、农作物病虫害防治和果蔬采后保鲜等领域[6-8]。研究发现，不同产地、采摘时间和处理方式获得的植物精油，其成分及抗氧化和抗菌活性有明显差异[9-11]。茵陈蒿(Artemisiacapillaris)属菊科蒿属植物，半灌木状草本，为我国传统中草药[12]。目前对茵陈蒿精油的研究主要集中在其成分分析[13]、抑菌活性[14]等方面，而关于茵陈蒿精油抑菌作用机理的研究尚未见报道。为此，本研究采用水蒸汽蒸馏法提取茵陈蒿精油，采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对其化学成分进行分析，并测定茵陈蒿精油的抗氧化能力及对病原菌的抑菌活性，采用扫描电镜观察茵陈蒿精油对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌细胞壁的影响，初步探究茵陈蒿精油抑菌作用机理，为蒿属植物精油开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料 茵陈蒿植株于2018年9月采自甘肃兰州西北师范大学(36°06′32.5″N， 103°44′03.62″E)，全株阴干后置于水蒸汽蒸馏系统中蒸馏2～3 h，收集提取物，用无水硫酸钠干燥后于4 ℃冰箱中保存备用。

病原细菌：大肠杆菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、 破伤风杆菌(Nicolaieri’sbacillus，ATCC 19406)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，CMCC 63501)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CMCC 26003)、 铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa，CMCC 10104)和荧光假单胞杆菌(Pseudomonasfluorescence，ATCC 13525),均由西北师范大学生命科学学院B518实验室提供。

病原真菌：白色念珠菌(Canidiaalbicans，ATCC 10231)、黄瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、小麦赤霉病菌(Fusahumgraminearum)、马铃薯立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，均由西北师范大学生命科学学院B518实验室提供。

1.1.2 仪器与设备 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ULTRA Plus扫描电子显微镜，德国；U2800紫外分光光度计，上海昂拉仪器有限公司；BSC-1300ⅡA2生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司； Multiskan FC 型酶标仪，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.2 茵陈蒿精油的化学成分分析

色谱柱：毛细管柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；原炉温度设定为60 ℃保持1 min，11 ℃/min升温至90 ℃保持2 min，2 ℃/min升温至95 ℃保持1 min， 18 ℃/min升温至180 ℃保持2 min， 2 ℃/min升温至185 ℃保持1 min，13 ℃/min升温至225 ℃保持2 min， 2 ℃/min升温至270 ℃保持1 min。喷射器温度保持在270 ℃。将1 μL茵陈蒿精油样品(用己烷稀释至1%)以1∶20的分流比注入。载气为氦气，流速为1.0 mL/min。在相同操作条件下,使用同系列正构烷烃(C5-C36)计算保留指数(RI)。采用保留指数(RI)值，以及NIST05和Wiley275文库鉴定其化学成分，通过平均GC-FID峰面积获得精油各个成分的相对含量[15]。

质谱参数: 电子轰击(E1)离子源70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度270 ℃；扫描范围30.00～500.00m/z；延迟时间3 min；程序时间35.33 min[16]。

1.3 茵陈蒿精油抗氧化活性测定

参考文献[17]的方法，采用DPPH测定茵陈蒿精油的抗氧化活性。将50 μL 2.5，5，7.5，10，12.5和15 μL/mL的茵陈蒿精油与5 mL DPPH乙醇溶液(0.004%)混合，避光室温放置30 min后，在517 nm处测定样品的吸光值。以乙醇和DPPH溶液空白样品作为阴性对照，试验重复3次。用下式计算DPPH的清除率(A)：

式中:A0为乙醇和DPPH溶液吸光值；A1为样品溶液吸光值。

1.4 茵陈蒿精油抑菌活性测定

1.4.1 琼脂扩散法测定抑菌圈直径 取5 mL无菌LB液体培养基，加入100 μL菌悬液，放入摇床中培养24 h备用；使用无菌水冲洗病原菌孢子，收集备用。在无菌条件下，吸取菌悬液和病原菌孢子悬浮液各100 μL，均匀涂抹在LB和PDA培养基中，取直径为6 mm滤纸片放置于含菌琼脂平板中央，然后向滤纸片上滴加5 μL茵陈蒿精油，以无菌水作为对照，培养皿封口培养24 h后测量抑菌圈大小[18]。抑菌圈试验判定标准为：抑菌圈直径>13 mm，病原菌对精油敏感；抑菌圈直径9～13 mm，病原菌对精油中度敏感；抑菌圈直径6～9 mm，病原菌对精油低度敏感；抑菌圈直径<6 mm，病原菌对精油不敏感。

1.4.2 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度值的测定 采用微量稀释法[19]测定茵陈蒿精油的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。将培养24 h新鲜活化的菌悬液，用无菌水稀释至106CFU/mL备用。使用LB液体培养基制备茵陈蒿精油稀释液320 μL/mL，在96微孔板上制备精油连续稀释液，取100 μL菌悬液(106CFU/mL)加入精油稀释液中，每个孔板中200 μL，将96微孔板置于37 ℃培养24 h后观察试验结果，试验样品均为细菌。以不添加精油的LB液体培养基为对照，每组试验重复3次。

参照MIC测定结果，首先观察孔板中有无可见菌株生长，将所有无菌株生长对应孔板中的菌株移至新鲜LB培养基中，在37 ℃下培养24 h，无菌株生长孔板中精油浓度判定为MBC，重新生长菌落的精油浓度为MIC。

1.4.3 毒力分析 采用菌丝生长速率法测定茵陈蒿精油对6种病原真菌的毒力。取培养7 d后直径为6 mm的病原菌菌饼接种于新鲜PDA培养基上，用1%土温-80将茵陈蒿精油稀释成5个浓度梯度(1.25，2.50，5.0，10.0，20.0 μL/mL)滴加至6 mm滤纸片上，以无菌水为对照，放置28 ℃恒温培养箱中培养5 d，采用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率，通过SPSS分析计算毒力回归方程(y=ax+b)、相关系数、95%置信区间和EC50，以EC50表示茵陈蒿精油对病原真菌菌丝生长抑制作用强弱[20]。

抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100%。

1.5 茵陈蒿精油对菌体细胞壁影响的电镜观察

参考Diao等[21]的电镜样品制备方法并稍作修改：离心收集活化菌种，用0.2 mol/L PBS(pH 7.2)重悬，再用茵陈蒿精油的MIC、MBC值相对应的浓度处理细菌3～4 h，对照组为等量的无菌水处理，用2.5%戊二醛固定2～4 h，PBS清洗3次后用乙醇梯度脱水，脱水后的菌体置于锡箔纸上镀金进行镜检。

1.6 数据处理

采用Excel统计试验数据，采用SPSS 20.0统计软件进行试验数据的显著性差异检验和方差分析，采用Origin 9.6作图。

2 结果与分析

2.1 茵陈蒿精油的化学成分

茵陈蒿精油的化学成分见表1。由表1可知，茵陈蒿精油共分离鉴定出24种化合物，其中烯类化合物种类最多，其次是醇类化合物。精油主要化学成分为蒿酮(37.59%)、乙酸丁酯(22.75%)和桉叶油醇(11.34%)，酯类、醇类、烯类和酮类化合物分别占23.51%,17.49%,16.59%和40.81%，可见精油中主要成分是酮类化合物。

表1 茵陈蒿精油的化学成分Table 1 Chemical composition of essential oil from Artemisia capillaris

2.2 茵陈蒿精油的抗氧化活性

由图1可以看出，茵陈蒿精油对DPPH自由基清除能力较强，且随着茵陈蒿精油浓度的增大，DPPH自由基清除能力越显著，抗氧化能力越强。当茵陈蒿精油浓度为15 μL/mL时，其对DPPH自由基的清除率达到90%以上；当茵陈蒿精油浓度为2.5 μL/mL时，DPPH自由基清除率在50%以上。

图1 茵陈蒿精油对DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effect of essential oil from Artemisia capillaris on DPPH radical

2.3 茵陈蒿精油的抑菌活性

2.3.1 茵陈蒿精油对病原菌的抑菌效果 茵陈蒿精油对供试病原菌的抑菌效果见表2。由表2可知，茵陈蒿精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、马铃薯立枯丝核菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌敏感；对大肠杆菌、破伤风杆菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜灰霉病菌中度敏感；对铜绿假单胞杆菌、荧光假单胞杆菌不敏感。因此茵陈蒿精油具有良好的抑菌效果。

表2 茵陈蒿精油对病原菌的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of essential oil from Artemisia capillaris on pathogenic bacteria

2.3.2 茵陈蒿精油对病原细菌的MIC和MBC 茵陈蒿精油对病原细菌的MIC、MBC结果见表3。由表3可知，茵陈蒿精油对白色念珠菌和枯草芽孢杆菌有最小的抑菌浓度，MIC均为2.5 μL/mL；对枯草芽孢杆菌有最小杀菌浓度，MBC为5 μL/mL。对大肠杆菌有最大的杀菌浓度，为150 μL/mL。说明茵陈蒿精油对枯草芽孢杆菌具有较好的抑制作用，对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌和荧光假单胞杆菌抑菌效果较差。

表3 茵陈蒿精油对供试病原细菌的MIC和MBCTable 3 MIC and MBC of essential oil from Artemisia capillaris on tested pathogenic bacteria

2.3.3 茵陈蒿精油对病原真菌的毒力测定结果 由于精油浓度及方法的不同，精油对菌丝和孢子萌发的抑制效果有所差异。由表4可知，茵陈蒿精油对小麦赤霉病菌、黄瓜灰霉病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌、马铃薯立枯丝核菌的EC50差异显著，其中小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌对精油最为敏感，EC50分别是3.371和5.898 μL/mL；毒力效果最小的是黄瓜灰霉病菌，EC50为10.942μL/mL；对辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉病菌的毒力敏感度相近，EC50分别为8.090和8.241 μL/mL。可见茵陈蒿精油可用于小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌的防治，对黄瓜灰霉病菌防治效果较差。

表4 茵陈蒿精油对病原真菌的毒力测定结果Table 4 Toxicity of essential oil from Artemisia capillaris to pathogenic fungi

2.4 茵陈蒿精油对病原菌菌体细胞壁的影响

根据以上茵陈蒿精油抑菌活性测定结果可知，茵陈蒿精油对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌活性明显，因此选用枯草芽孢杆菌和白色念珠菌作为代表菌株，用扫描电镜(SEM)观察茵陈蒿精油对2株菌体细胞壁的影响。

2.4.1 对枯草芽孢杆菌细胞壁的影响 茵陈蒿精油对枯草芽孢杆菌细胞壁的影响见图2。对照枯草芽孢杆菌菌体形态呈典型杆棒状，菌体完整，无菌体内容物外渗 (图2-A)；用MIC和MBC值对应的精油浓度分别处理枯草芽孢杆菌4 h后，枯草芽孢杆菌细胞表面出现大量褶皱，表面粗糙，细胞壁不完整，内容物渗出，通透性增强，菌体破碎(图2-B-C)。茵陈蒿精油浓度越大，对枯草芽孢杆菌菌体细胞的破坏力越强，用茵陈蒿精油处理枯草芽孢杆菌时，可能会使其菌体细胞壁上产生孔洞，导致细胞内容物渗出，影响菌体基因表达、能量代谢等途径，从而导致枯草芽孢杆菌细胞衰竭(图2-B-C)。

A.对照；B.MIC值对应精油处理；C.MBC值对应精油处理A.Control;B.MIC essential oil treatment;C.MBC essential oil treatment 图2 茵陈蒿精油对枯草芽孢杆菌细胞壁的影响(×(119.07×103))Fig.2 Effect of essential oil from Artemisia capillaris on cell wall of Bacillus subtilis (×(119.07×103))

2.4.2 对白色念珠菌细胞壁的影响 茵陈蒿精油对白色念珠菌细胞壁的影响见图3。对照白色念珠菌菌体呈典型的圆球状，表面光洁平整，菌体完整，无菌体内容物外渗(图3-A)。用MIC和MBC值对应的精油浓度处理白色念珠菌4 h后，白色念珠菌表面出现褶皱，细胞壁不完整，内容物渗出，菌体破裂；精油浓度越大，对白色念珠菌菌体的影响越大。用茵陈蒿精油处理白色念珠菌时，会导致白色念珠菌菌体细胞壁上形成孔洞，其细胞内容物质渗出，从而使白色念珠菌菌株死亡。

3 讨 论

本试验结果表明，从茵陈蒿精油中分离鉴定的化合物有24种，占精油总量的100%，其主要物质为蒿酮(37.59%)、乙酸丁酯(22.75%)和桉叶油醇(11.34%)。周宇杰[22]研究发现，茵陈蒿精油中化合物成分主要为倍半萜和单萜两大类，这与本试验结果相吻合；赵娜娜等[23]研究发现，从茵陈蒿植株中提取的主要物质为大根香叶烯D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、α-毕橙茄醇(7.03%)、依兰油醇(4.83%)5种，占已鉴定出化学成分的47.14%；杨书斌等[24]研究表明,不同时期茵陈蒿花蕾的主要成分为茵陈二炔(31.4%)、β-石竹萜烯(21.64%)、β-香叶烯(8.84%)、d-柠檬烯(6.03%)和少量单萜烯类化合物，这与本研究提取的茵陈蒿精油主要成分有较大差异。这可能是受到茵陈蒿的产地[25]、部位[26]、季节不同，导致其化学组成有差异。茵陈蒿精油相对于当归、迷迭香、丁香、艾叶[24]等植物精油具有良好的抗氧化活性。

曾琳等[27]研究表明，粗榧精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC为0.6～0.8 mg/mL；艾蒿精油对枯草芽孢杆菌的MIC为5 μL/mL[28]。本研究结果表明，茵陈蒿精油对白色念珠菌和枯草芽孢杆菌的MIC和MBC值均较小，说明这2种菌体对茵陈蒿精油较其他菌株敏感。扫描电镜观察发现，茵陈蒿精油可使这2种菌体细胞壁和孢子皱缩，从而导致细胞壁通透性增强，细胞内容物渗出，而且精油浓度越大，对菌体细胞壁破坏越强，甚至会发生自身溶解迹象[29]。