秦巴山区虫生真菌的分离鉴定与多样性分析

王 军,张 琨,张 绪,刘 柳,宁硕瀛,陈 川,万 一

(1 陕西省微生物研究所 分子生物学研究中心, 陕西 西安 710043;2 陕西省科学院 秦岭天然产物工程中心,陕西 西安 710043; 3 陕西理工大学 生物科学与工程学院, 陕西 汉中 723000;4 陕西省动物研究所,陕西 西安 710032)

虫生真菌(entomogenous fungi)是指寄生在昆虫(或其他节肢动物)幼虫或成虫上的真菌[1]。虫生真菌对人类、环境和非靶标生物的安全性较高，能够大量生产，且易在害虫间流行，因此在农林害虫种群控制及生物防治中发挥着关键作用[2-3]。能够侵入昆虫体内寄生、导致昆虫发病致死的真菌称为昆虫病原真菌。虫生真菌是最大的昆虫病原微生物类群，目前报道的有100多属800种以上，寄主范围广泛[4-5]，是重要的害虫生物防治资源。在生产上已得到广泛应用的主要有白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌等，报道的常见真菌杀虫剂有8类约30种商品[6-7]。

随着我国农林业的不断发展，优势品种的单一种植及高密度连作等耕作环境的改变导致虫害逐年严重。一直以来对化学防治的依赖，造成环境污染、农药残留和抗药性问题日益严重。而生物防治具有高效、低毒、低残留等特点，在昆虫病害防治中发挥着越来越重要的作用，因此开展虫生真菌种质资源研究，调查不同生境下虫生真菌的物种多样性、群落结构及其生态分布规律，对开发生物农药具有重要作用[8-9]。Tzean等[10]系统调查了台湾地区虫生真菌的物种多样性，得到了24属66种虫生真菌，同时对分离的虫生真菌种群结构进行研究。戴建青等[11]对山西省虫生真菌的种类和资源进行调查，共分离到虫生真菌4目19属67种，其中拟青霉属和镰孢霉属等6属为优势类群。刘玉军等[12]对安徽紫蓬山虫生真菌多样性和分布特点研究表明，该区域虫生真菌数量丰富，但物种多样性指数较低，共得到436株虫生真菌，鉴定为3科6属13种。以上报道为我国在各地因地制宜开展虫生真菌的研究、开发工作提供了有益借鉴。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品采集 2018-2019年连续2年，在5-9月从汉中市留坝县、商洛市柞水县、宝鸡市凤县、西安市周至县和鄠邑区5个不同地区(图1)，选择阔叶林、针叶林及低矮灌木等不同生境进行昆虫采集，分别在树木的树干、叶面以及地表等处采集罹病昆虫尸体标本。为了避免杂菌干扰，采集后的样本分别单独保存于4 ℃冰箱内，并及时分离处理[14]。5个采样地具体信息如下：留坝县(106°58′15″E，33°22′42″N)，海拔585～2 610 m，年平均气温11.5 ℃；柞水县(108°68′07″E， 33°38′13″N)，海拔1 000～2 800 m，年平均气温12.9 ℃；凤县(106°38′11″E， 34°08′21″N)，海拔1 010～2 738 m，年平均气温11.4 ℃；周至县(108°20′15″E，33°57′02″N)，海拔388～3 015 m，年平均气温13.8 ℃；鄠邑区(107°19′03″E，33°45′32″N)，海拔399～3 762 m，年平均气温13.6 ℃。

图1 秦巴山区昆虫样本采集区域Fig.1 Insect samples collection areas in Qinba Mountains

1.1.2 培养基及仪器 孟加拉红培养基和PDA培养基，均购于北京陆桥技术有限责任公司；引物ITS1和ITS4，均由上海捷瑞生物有限公司合成；真菌基因组试剂盒，购于北京天根生化科技有限公司；Chelex-100，购于Sigma公司；机械破壁仪，购于QIAGEN公司；离心机(XI)，购于基因有限公司；PCR扩增仪(T100)，购于BIO-RAD公司。

1.2 虫生真菌的分离纯化

1.2.1 昆虫样品前处理 在无菌操作台上，用消毒剪刀剪去昆虫触角、足、翅等器官。表面肉眼可见菌丝体的虫体直接分离。表面无菌丝的虫体，先用无菌水清洗昆虫体表，再用体积分数75%乙醇浸泡30 s，然后用质量分数0.5%次氯酸钠浸泡2 min，最后用无菌水清洗。然后将虫体置于2 mL离心管中，加1 mL 0.9% NaCl和2颗无菌钢珠于破壁仪中匀浆2 min。匀浆液按照100～10-5进行梯度稀释，于4 ℃保存备用[15]。

1.2.2 虫生真菌的分离纯化 对表面肉眼可见菌丝体的虫体，直接置于孟加拉红培养基平板上培养。表面无菌丝的虫体经处理后，用移液枪分别吸取各梯度匀浆液0.1 mL，均匀涂布于孟加拉红分离培养基上，25 ℃恒温培养3～14 d，待有菌丝长出时，及时用接种环挑取边缘菌丝转接到孟加拉红培养基上进行纯化，如此反复数次，直至得到纯培养菌株，于4 ℃保藏待用[16]。

1.3 虫生真菌的分类鉴定

1.3.1 形态学鉴定 在无菌操作台上，用接种环挑取适量菌丝在PDA培养基上进行平板划线后，将高压灭菌的盖玻片45°倾斜插入培养基，25 ℃恒温培养2～3 d，观察菌落颜色、形态、质地等特性，待盖玻片上爬满菌丝，取下盖玻片制成切片，在光学显微镜下观察其孢子大小、形态特征、菌丝分枝情况等，并根据《昆虫真菌学》[2]进行形态鉴定。

1.3.2 分子生物学鉴定 (1)真菌DNA提取。采用改良真菌PCR反应模板获取方法[17]进行以下操作：在无菌操作台，取0.1 mL 10×Buffer TE(100 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,pH 8.0)于2 mL离心管中，用无菌接种环挑取菌体至离心管中，迅速振荡混匀后加1颗无菌钢珠，在机械破壁仪中40 Hz机械破壁1 min，随后用无菌镊子取出钢珠，将其置于微波炉700 W高温裂解3 min，待温度降至室温，离心获取上清液作为DNA模板[18]。

(2)PCR扩增。以提取的真菌DNA为模板，以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGTTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′)对虫生真菌的rDNA-ITS区域进行PCR扩增。PCR扩增反应体系：2×Master Mix 15 μL，ITS1 0.5 μL，ITS4 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 12 μL。PCR扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。

(3)ITS序列分析。将PCR产物送至北京奥科生物有限公司进行测序，将测序获得的碱基序列在 NCBI网站上进行BLAST比对，获取相似度高的菌株信息，并结合形态学鉴定结果，最后确定菌株的分类地位[19]。

同志们，龙年伊始，万象更新。让我们抓住水利发展的大好时机，积极进取，奋发有为，开拓创新，全力做好规划计划工作，为加快推进水利改革发展作出新的更大的贡献！

1.4 多样性分析

对分离得到的虫生真菌进行种属统计，采用Simpson多样性指数(D)、Shannon-Wiener指数(H′)和均匀度指数(Pielou)(E)分析秦巴山区虫生真菌的多样性[20]。

E=H′/Hmax。

式中：S为物种数目；Pi为物种个体数占物种总个体数比例，Pi=Ni/N，Ni是样本中第i物种的个体数，N是所有物种的个体数；H′为实测多样性值；Hmax为最大多样性值，Hmax=lnS。

2 结果与分析

2.1 秦巴山区虫生真菌的分离鉴定

由表1可见，2018-2019年从秦巴山区5个不同地区采集到昆虫样本243只，归属于8目。以单个虫体为样本，对采集的243只昆虫分别进行分离纯化，共得到187株真菌。其中鳞翅目、鞘翅目、半翅目和同翅目昆虫的出菌率均在90%以上，说明采样地区的此类昆虫易于被虫生真菌感染。

表1 秦巴山区昆虫采集数量及其出菌率Table 1 Quantity of insect collection and plating efficiency in Qinba Mountains

结合形态学特征与分子生物学鉴定结果，对分离得到的187株真菌菌株进行分类地位统计，结果(表2)表明，187株真菌归属于丛梗孢目、散囊菌目、毛霉目等9个目，暗色孢科、丛梗孢科、发菌科等13个科，棒束孢属、绿僵菌属、白僵菌属、交链孢霉属、枝孢属、镰刀菌属、篮状菌属等22个属。

表2 秦巴山区虫生真菌类群组成及分离频率Table 2 Composition and isolation frequency of entomogenous fungi in Qinba Mountains

表2(续) Continued table 2

2.2 秦巴山区虫生真菌多样性

从表2可以看出，187株真菌中，有120株真菌(64.17%)属于丛梗孢目(Moniliales)，归属于2科9属。其中棒束孢属(Isaria)占比最大，有35株，约占18.72%;其次为枝孢属(Cladosporium)，约占13.90%。经计算，Simpson多样性指数(D)为0.902，Shannon-Wiener指数(H′)为2.574，这说明秦巴山区虫生真菌群落有一定的多样性；而均匀度指数(Pielou)(E)为0.833，说明秦巴山区真菌群落物种均匀度偏低，优势种属现象较为明显。

5个昆虫样本采集地区的虫生真菌种群多样性如表3所示。由表3可知，Shannon-Wiener指数(H′)差异明显，表明5个地区虫生真菌群落均具有一定的多样性，而均匀度指数(E)较高，说明5个地区物种分布的均匀程度较高。留坝县、柞水县、凤县和鄠邑区的优势菌属均为棒束孢属(Isaria)，周至县的优势菌属为枝孢属(Cladosporium)，但均不占绝对优势。

表3 秦巴山区昆虫虫生真菌种群分布Table 3 Distribution of entomogenous fungi in Qinba Mountains

对不同地区采集的昆虫数及分离到的虫生真菌菌株数进行比较，结果见图2。由图2可知，采自柞水县、鄠邑区和周至县的昆虫出菌率较高(平均检出率为106.17%)，留坝县和凤县的出菌率稍低(平均检出率为58.16%)，推测可能是留坝县和凤县的年平均气温低于其他3个地区，不利于虫生真菌的发生流行；也可能是留坝和凤县的采样山区较其他3个山区离城市更远，自然生态环境更好，采集的昆虫受人类活动干扰比较小。

图2 秦巴山区不同采样区昆虫数及虫生真菌菌株数Fig.2 Number of insects and entomogenous fungi in different sampling areas in Qinba Mountains

3 讨 论

虫生真菌是农林业害虫种群调节的重要因子和生物防治的重要资源。利用虫生真菌防治害虫，已逐步成为一种以生物防治为主导的综合治理重要途径[21]。自20世纪50年代以来，我国学者先后对20多种虫生真菌进行研究，已登记注册并商品化的虫生真菌制剂有40余种[22]。

为探索秦巴山区农林作物害虫生防菌种资源，本研究于2018-2019年连续2年以秦岭不同地区为采样点，选择阔叶林、针叶林及低矮灌木等不同生境进行昆虫采集及虫生真菌的分离、鉴定，结果表明，从陕西境内秦巴山区5个不同地区共采集昆虫样本243只，分离得到虫生真菌187株，经形态学和分子生物学鉴定，分离得到的187株虫生真菌归属于丛梗孢目、散囊菌目、毛霉目等9个目，暗色孢科、丛梗孢科、发菌科等13个科，交链孢霉属、枝孢属、拟青霉属等22个属。优势目为丛梗孢目(Moniliales)，除周至县外其他4个地区的优势菌均为棒束孢属(Isaria)。多样性分析结果表明，秦巴山区虫生真菌群落多样性较为丰富，具有一定的多样性；优势种属现象较为明显，群落物种均匀度偏低。5个不同昆虫采集地区之间的虫生真菌群落具有一定的多样性，物种分布的均匀程度较高[23]。在采集的昆虫种类中，以鳞翅目、鞘翅目、半翅目和同翅目昆虫的出菌率较高，说明采样地区的此类昆虫易于被虫生真菌感染，这为后续开发生物农药提供了一定的靶标参考。本研究的5个采样地区，仅能够初步代表秦巴山区虫生真菌资源的多样性及分布规律，但还不够全面，因此还需要收集更多地区的样本进行分析。

目前虫生真菌的群落生态学和多样性研究已逐步得到重视[24]。采用昆虫真菌学和群落生态学相结合的研究方法，调查研究不同生境下虫生真菌物种的多样性、群落结构及其生态分布规律，加强对虫生真菌的生物学特性、与寄主相互关系和自然分布状况的了解，为虫生真菌资源的合理保护和持续利用提供科学依据[25-26]。

4 结 论

秦巴山区虫生真菌种类多、分布广，多样性较为丰富。该研究充实了陕西省境内秦巴山区微生物资源信息，为该地区虫生真菌资源的分布、多样性研究及开发利用提供了有益参考，也为后续真菌代谢产物的活性探索以及农林虫害的生防研究奠定了基础。