基于三苯基磷的线粒体靶向荧光探针研究进展

杨洪高，马 杰*，李 明，谭绍英，黄军海*

（1. 上海理工大学，上海 200093；2. 上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 201203）

线粒体是双膜结合的亚细胞器，是细胞主要能量来源，在细胞生命过程中发挥重要作用。线粒体内活性小分子（活性氧、硫、氮等）作为信号载体参与线粒体内生物化学反应，其浓度和时空分布能够影响细胞乃至整个生命体性状表现。因此，开展线粒体内活性小分子的相关研究对揭示生命体活动规律起着至关重要的作用。荧光探针与传统方法（比色法、气相色谱法等）相比具有时空分辨率高、可操作性强、选择性高、成本低等显著优势[1]，现已成为检测线粒体内各种相关活性物质及其实时变化的重要手段之一。

通过结合靶向基团设计了一系列靶向线粒体的荧光探针，目前，靶向基团主要有三苯基磷（TPP）和季铵盐阳离子两种，两者在线粒体膜电势（150～180 mV）的驱动下精准进入线粒体内，但是，有机磷小分子具有良好的水溶性和生物相容性[2]，因此，基于TPP的线粒体靶向荧光探针的细胞通透性更好，选择性更高，整体检测性能更佳，成为了靶向线粒体荧光探针领域的研究热点。

本文为更好的认识线粒体在细胞生命过程中扮演的角色，将根据线粒体中所检测的活性物种类进行梳理，重点分析了该类荧光探针的优缺点，并提出总结与展望。

1 检测活性氧的荧光检测探针

活性氧（ROS）主要产生于细胞线粒体中，用于维持细胞内氧化还原平衡，并参与细胞内各种生理代谢过程。异常含量的ROS将会引发各种疾病，准确检测线粒体中的ROS时空变化具有重要意义。线粒体内ROS具有多样性（如ClO-、H2O2、O2•-、NO等）、不稳定性和高活性等特征，小分子荧光探针在某种程度上能有效克服上述困难，是检测该类ROS的有力手段之一。

1.1 检测ClO-的荧光检测探针

ClO-是重要的活性氧之一，在线粒体中，由过氧化物酶催化氯离子和过氧化氢反应产生[3]，在多种生理和病理过程中起着重要作用。因此，维持ClO-正常水平是维系细胞功能的必要条件，一旦超出正常浓度范围就会引发各种疾病。

2014至2019 年，Yu和Zhang团队以罗丹明为母核，以TTP作为线粒体定位基团分别合成荧光探针1、2、3、4。探针1[4]具有高选择性和快速响应，但其细胞毒性相对较大，限制了其生物应用。探针2[5]与探针1相比，在生物体内基本不受背景荧光影响，且具有较大的斯托克位移，荧光性能更佳。探针3[6]引入生物素作为肿瘤特异性基团，具有良好的细胞膜通透性、线粒体实时传感与成像、肿瘤细胞特异选择性，具有较好应用潜力。探针4[7]具有较大的双光子（TP）截面（267 GM）和近红外发射光谱，表现出优异的低自荧光、光稳定性、深部组织穿透（230 mm）等特性。2015年，Ma团队基于罗丹明硫内酯构建荧光探针5[8]，硫原子锁定的螺环结构开环后，生成共轭系统，荧光发射增强、响应时间短、检测限低，成功应用于巨噬细胞中ClO-的检测，具有实际应用潜力。

2013年，Peng团队以肟为响应基团合成荧光探针6[9]，独特的异构化结构（C=N）作为荧光探针开关，该探针在数十秒内可实现对ClO-响应，在实时检测方面具有较好的应用前景。2015、2018年，Wang和Hua团队分别合成比率型荧光探针7[10]、8[11]，探针7是第一个检测线粒体中ClO-的比率型荧光探针，其共轭结构减少而发生蓝移，成功应用于活体老鼠内源性ClO-的检测（图2），探针8引入烷基链等特殊结构，其溶解度和水溶性有所提高，在检测过程中，探针7、8均具有较大的斯托克位移和肉眼可见的荧光变化。

图2 探针6、8的化学结构式，及探针7的识别机理和裸鼠荧光图像，探针7注射浓度（50 μL×20 μmol /L），分别孵育0、5、10、15、20、30、45和60 min所得图像[7]

2015、2016年，Chang和Kin团队分别合成TP荧光探针9[12]、10[13]。探针9是首个靶向线粒体ClO-的TP荧光探针，存在一个典型的“推拉”（胺酮）结构，具有优异的光物理特性，在500 nm处的荧光强度增强约670倍，成功应用于发炎小鼠模型中的巨噬细胞，在炎症组织中能够观察到巨噬细胞中探针9发出较强的绿色荧光，通过巨噬细胞标记物CD11b对组织切片进行免疫染色进一步证实（红色）。探针10以咪唑啉-2-硫酮为ClO-响应位点，响应后的产物具有很好的水溶性和稳定性，在HeLa细胞的共染色实验中显示出较大的皮尔逊共定位系数（0.83）。2019年，Wang团队以香豆素为骨架合成荧光探针11[12]，C-O键作为ClO-的识别受体，表现出优异的荧光性能。

图3 探针9～11的化学结构式

1.2 检测H2O2的荧光检测探针

过氧化氢（H2O2）是氧代谢的重要产物，主要产生于线粒体中，与人类许多疾病密切相关[13-15]，与细胞存活、生长、分化和维持息息相关[18-19]。

芳基硼酸盐是典型的H2O2响应基团，与H2O2高特异性反应生成苯酚，从而实现对线粒体内H2O2的检测。2012年，Kim团队合成第一个靶向线粒体H2O2的比率型荧光探针12[20]，硼酸酯裂解可引发氨基甲酸酯键的裂解，从而释放出更多的电子富集体，并伴随明显的蓝黄色荧光发射，能够在不受其它相关物干扰的情况下对活细胞和活组织中线粒体H2O2实时成像（图4），但其响应时间过长。

图4 探针12的识别机理及细胞荧光成像，（a）探针12的TMP线粒体荧光成像，（b）线粒体红色荧光染料的 OPM荧光成像，（c）共定位荧光成像[18]

2016年，Li团队以咔唑为母体合成荧光探针13[21]，在深度为105 μm处，可长时间检测活细胞和组织中H2O2，成像质量极佳。2018年，Dai团队以萘酰亚胺为母体合成荧光探针14[22]，在543 nm处有强烈的荧光发射，具有较好的水溶性和低细胞毒性，有望实现活细胞中H2O2的检测。2019年，Zhao团队基于双淬灭概念合成荧光探针15[23]，芳基硼酸盐驱动内酰胺的形成，同时，邻位猝灭剂的引入使得能量从荧光团转移到猝灭剂，实现对荧光基团双淬灭，在H2O2存在的条件下，内酰胺环打开，淬灭剂释放，荧光基团重新发出强烈的荧光，该探针成功应用于癌细胞线粒体中H2O2的检测，为荧光探针设计提供一种新的思路。

图5 探针13～15的化学结构式

1.3 检测O2•-的荧光检测探针

在线粒体环境中，超氧阴离子（O2•-）会迅速转化为H2O2，进而形成其它的ROS，其浓度可以从侧面反映ROS水平[24]。Tang团队合成了TP荧光探针16[25]、17[26]，探针16是第一个检测O2•-的TP反应型荧光探针，与O2•-发生脱氢反应后，其共轭体系延长，放出较强荧光，成功应用于小鼠体内O2•-的检测，并且该探针具有良好的光稳定性（图6）。探针17是一种可逆TP荧光探针，其独特的结构能够同时对O2•-和pH响应，且有高的时间分辨率和较小的背景荧光干扰。2016年，Zhang团队以萘酰亚胺为母体合成荧光探针18[27]，9-甲基蒽作为荧光淬灭剂和O2•-捕获剂，该探针首次成功应用于光动力治疗（PDT）过程中活细胞和组织中O2•-的荧光成像，有望成为研究线粒体PDT过程中O2•-生成的有力工具。

图6 探针16的识别机理和光稳定荧光成像[23]，及探针17、18的化学结构式

1.4 检测NO的荧光检测探针

一氧化氮（NO）是一种信使分子，在各种生理和病理过程中发挥重要作用，内源性NO在心血管系统、免疫系统等生理系统中介导多种生理过程[28]，实时监测线粒体中NO对化学、生物学研究具有重要意义。

2013年，Jin团队研制出第一个靶向线粒体中NO的“off-on”型荧光探针19[29]，该探针的响应与NO促使邻苯二胺氧化有关，检测过程中出现肉眼可见的强烈洋红色荧光，且在10 nm至50 nm范围内呈现良好的线性相关，该探针成功应用于人乳腺癌MCF-7细胞线粒体中NO的成像（图7）。2017年，He团队引入NO识别基团二氢吡啶合成荧光探针20[30]，用于检测活细胞、组织和生物体内线粒体NO的变化，该探针不受其它活性氧、氮的干扰，有望成为评价生物内NO水平的有效工具。

图7 探针19的识别机理和线粒体共定位荧光成像[27]，及探针20的化学结构式

2 检测还原性物质的荧光检测探针

在线粒体中，存在另一种与ROS同等重要的物质―平衡ROS的还原性物质（H2S、硫醇、SCN-、谷胱甘肽等）。为了更好的了解线粒体内氧化还原过程，还原性小分子荧光探针的研究具有同等重要的意义。

2.1 检测H2S的荧光检测探针

硫化氢（H2S）作为公认的第三类内源性气体传递物质，在生物系统中具有不可替代的作用。2013年，Kim团队合成第一个检测线粒体H2S的含磷TP荧光探针21[31]，该探针以叠氮基为响应位点，在H2S存在下，该探针荧光发生红移（图8a），且容易进入细胞，受其它活性物质（活性硫、氧、氮）的干扰较小，可用于测量DJ-1缺陷型星形胶质细胞和脑切片中内源性H2S水平（图8b）。

图8 探针21的识别机理和荧光成像，（a）荧光强度随时间的变化（1 mol/L探针21与100 mol/L Na2S作用），（b）切片后培养7天，以稳定切片应力对组织的影响，测量H2S的产生[29]

2016年，Lee团队以7-硝基-1,2,3-苯并恶唑（NBD）胺作为H2S响应基团合成荧光探针22[32]，H2S诱导NBD胺键硫解后可获得显著的荧光off-on，成功用于细胞内成像，可进一步用于研究生命系统中H2S的生物学功能和病理作用。2017年，Hua团队以苝（NP）为荧光基团，硝基为反应位点合成荧光探针23[33]，柔性烷基链和大分子基团的引入，有效地提高该探针的溶解度、选择性和稳定性，使其更易应用于生物体系的检测。2018年，Kim团队报道了TP比率荧光探针24[34]，芳基硫代酯具有较高的电子亲核性，在H2S存在的条件下，氨基甲酸酯连接基团被移除，内部电荷转移（ICT）的抑制被解除，荧光由绿转黄，发生红移。同年，Min团队基于受激拉曼散射成像技术合成荧光探针25[35]，以叠氮化单元作为反应位点，可通过SRS显微镜观察活细胞中的H2S，具有很好的响应，这种方法具有普遍应用于生物系统中其它重要生物分子检测的潜力，此外，未来有望实现单个细胞内不同小分子物质的超多路传感。

图9 探针22～25的化学结构式

2.2 检测RSH的荧光检测探针

为了解硫醇（RSH）在生物学中的作用，在组织和有机体水平上监测RSH是至关重要的。2011年，Cho团队合成第一个检测RSH含磷的TP比值荧光探针26[36]，该探针在生物系统内对pH不敏感，具有显著的双光子截面，荧光变化明显（蓝转黄），可在90～190 μm深度的细胞组织中实现线粒体中RSH水平可视化（图10）。

图1 探针1～5的化学结构式

图10 探针26的识别机理和小鼠海马切片的荧光成像，（a和d）以CA1、CA3为亮场的明场图像，（b和e）为 用NEM处理前后的TMP图像，（c和f）为（b）和（e）中红色框的放大图像，深度为120 mm[34]

2012年，Kim团队设计合成荧光探针27[37]，该探针以二硫键作为硫醇还蛋白的识别基团，当与硫醇还蛋白作用后，发射出强烈的绿色荧光（λem＝540 nm），检测限可达 50 nmol/L。2013年，Ahn团队合成荧光探针28[38]，该探针由硫醇介导芳基磺酰叠氮化物向磺胺类物质转化，从而实现荧光的发射，可应用于检测所有生物硫醇。

图11 探针27、28的化学结构式

表1 线粒体荧光探针的性能

3 总结与展望

小分子靶向线粒体荧光探针在近十年取得长足的进展，是传统检测手段的有益补充。含磷有机小分子荧光探针虽然应用广泛，但也存在诸多不足，首先，其稳定性有待提高，有机磷容易被氧化，荧光探针容易被生物体内的活性氧淬灭，其次，对于靶向线粒体的荧光探针通常依赖于线粒体膜电势，携带正电荷的TPP基团进入势必会影响正常的电势差，最终一定程度上会影响线粒体的正常生物学功能。因此开发电中性线粒体荧光探针具有重要意义。