奥贝胆酸关键杂质二聚体的合成

舒 兵，郑 滔，谢晓玲，邓南翔，张尚师*

（1. 广东药科大学 药学院，广东 广州 510006；2. 广东药科大学 新药研究中心，广东 广州 510006）

奥贝胆酸（obeticholic acid,OCA，图1）通过激动法尼醇X受体（farnesoid X receptor,FXR），间接抑制细胞色素7A1（CYP7A1）的基因表达，抑制胆酸的合成，用以治疗对熊去氧胆酸应答补加或者无法耐受的原发性胆汁性胆管炎，具有较高的安全性[1-4]。但是，在生产奥贝胆酸原料药的过程中，需要将溶液调至酸性，以促进奥贝胆酸的析出。而强酸性环境可以促进奥贝胆酸的羧基和羟基发生缩合反应，可能产生奥贝胆酸二聚体杂质，影响其纯度和安全性（A-5，图1）[5-6]。为了更好的控制奥贝胆酸的质量，必须对其中的二聚体杂质进行研究，建立该杂质的质量标准。因此，制备该杂质作为对照品，用于杂质分析和研究，显得很有必要。

图1 奥贝胆酸（OCA）和奥贝胆酸二聚体A-5的结构

目前，文献报道的主要方法是将两分子奥贝胆酸直接在酸性条件下进行反应，得到的副产物较多、产率低（产率1.9%）、分离困难，难以用于杂质研究[7-8]。本研究针对上述合成方法的不足，以二聚体的结构为基础，制定了合理的合成路线。以奥贝胆酸为起始原料，分别上苄基保护基和TMS保护基，得到了3α，7α-二羟基-6α-乙基-5-β-胆烷酸苄基酯A-1和3α-三甲基硅氧基-7α-羟基-6α-乙基-5-β-胆烷酸A-3两个关键中间体。将两者进行缩合反应得到酯，然后脱去保护基，得到奥贝胆酸二聚体A-5（图2），总收率达30%。同两分子奥贝胆酸直接缩合的方法相比，本方法具有产率高、纯化方便等优点，合成出的二聚体杂质，能够用于奥贝胆酸的质量研究。

1 实验

1.1 仪器与试剂

实验仪器：DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南巩义宇华有限公司）；手提式紫外分析仪（杭州齐威仪器有限公司）；旋转蒸发仪（东京理化-上海艾朗仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（巩义市科瑞仪器有限公司）；Advance Bruker 400M超导核磁共振波谱仪（瑞士BRUKER公司）；Thermo超高效液相色谱串联质谱仪（赛默飞世尔科技公司）。

主要试剂：奥贝胆酸、溴化苄（萨恩化学技术有限公司）；4-二甲氨基吡啶、三甲基氯硅烷（上海毕得医药有限公）；碳酸钾、DMF、三乙胺、二环己基碳二亚胺（上海泰坦科技有限公司），其他试剂均为市售分析纯。

1.2 合成实验操作

1.2.1 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（A-1）的合成

于250 mL圆底烧瓶中，加入奥贝胆酸（OCA,5.0 g,11.0 mmol），溴化苄（3.1 g,17.85 mmol,1.5 eq），无水碳酸钾（2.5 g,17.85 mmol,1.5 eq），最后加入无水DMF（80 mL），将反应体系于60℃下搅拌20 h。反应毕，停止反应，放冷至室温，倒入含有100 mL冰水和100 mL的乙酸乙酯EA混合溶液中，搅拌5分钟后，加硅藻土过滤，滤液分液，水层加30 mL EA萃取两次，合并有机层，加饱和食盐水Brine（50 mL）洗二次，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干得粗品，加硅胶柱层析（PE/EA＝10/1～4/1），得到中间体A-1。

1.2.2 3α-三甲基硅氧-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（A-2）的合成

于250 mL圆底烧瓶中，加入中间体A-1（3.0 g,5.88 mmol）和甲苯（80 mL），将反应体系于0℃下搅拌10 min后，先后滴加三甲基氯硅烷（1.4 g,12.94 mmol,2.2 eq）和三乙胺（2.4 g,23.53 mmol,4.0 eq），将反应体系于60℃油浴中搅拌过夜。反应毕，停止反应，放冷至室温，倒入含有80 mL冰水和80 mL的EA混合溶液中，搅拌5 min后，分液，水层加20 mL EA萃取三次，合并有机层，加Brine（50 mL）洗二次，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干得粗品，加硅胶柱层析（PE/EA＝40/1～10/1），得到中间体A-2。

1.2.3 3α-三甲基硅氧-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（A-3）的合成

于100 mL圆底烧瓶中，加入中间体A-2（2.0 g,3.06 mmol）和无水乙酸乙酯（60 mL），加入湿钯碳（100 mg,10%含量），反应体系换H2，置换5次，于室温下，氢气环境中搅拌2 h，反应毕，停止反应，加硅藻土过滤，滤液旋干，得A-3粗品，无需纯化，直接投下一步反应。

1.2.4 3α-{3-[3α-羟基-7α-三甲基硅氧-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（A-4）的合成

于100 mL三颈烧瓶中，加入中间体A-1（1.0 g,1.96 mmol），中间体A-3（1.2 g,2.15 mmol,1.1 eq），二环己基碳二亚胺（DCC,0.6 g,2.94 mmol,1.5 eq）和4-二甲氨基吡啶（DMAP,23.9 mg,0.2 mmol,0.1 eq），将体系换N2保护，换气三次，加入50 mL重蒸二氯甲烷，将反应体系于室温中搅拌3小时。反应毕，停止反应，加入50 mL冰水，搅拌10分钟后过滤。滤液分液，水层加20 mL二氯甲烷萃取两次，合并有机层，加Brine洗一次，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干得粗品，加硅胶柱层析（PE/EA＝40/1～10/1），得到中间体A-4。

1.2.5 3α-{3-[3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（A-5）的合成

称取A-4（180 mg,0.183 mmol）于100 mL反应瓶中，加15 mL乙酸乙酯溶解，加入20 mg Pd/C，H2换气三次后室温搅拌1 h后，滤去Pd/C，往滤液中加入10 mL乙酸乙酯和10 mL水，滴加0.3 mL浓盐酸，室温搅拌半个小时，反应完毕，分液，水层加10 mL EA萃取一次，合并EA层，饱和食盐水洗一次后无水硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干，硅胶柱分离得到奥贝胆酸二聚体A-5。

2 结果与讨论

2.1 合成路线

本研究采用逆合成分析法分析奥贝胆酸二聚体杂质的合成路线。将奥贝胆酸二聚体拆分为两分子的奥贝胆酸，分别对奥贝胆酸的羟基基团和羧基基团予以保护，得到一分子羟基保护基的奥贝胆酸和一分子羧基保护的奥贝胆酸羧酸酯，通过酯缩合、脱保护得到奥贝胆酸二聚体。首先，将奥贝胆酸在碳酸钾条件下与溴苄发生亲核反应得到奥贝胆酸苄酯A-1。接着与三甲基氯硅烷（TMS-Cl）反应得到TMS保护的TMS奥贝胆酸苄酯A-2，经氢气钯碳体系还原，得到TMS奥贝胆酸A-3。TMS奥贝胆酸与奥贝胆酸苄酯在DCC/DMAP体系下发生酯缩合反应得到奥贝胆酸二聚体前体A-4，最后经氢气钯碳体系还原、酸性条件下脱苄基和TMS保护基得到目标产物奥贝胆酸二聚体A-5（图2）。

图2 奥贝胆酸二聚体A-5的合成路线

2.2 3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（A-1）的分析数据

参照实验操作“1.2.1”，得到4.2 g白色固体A-1，产率87%，mp:54.1～57.6℃，1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ7.40～7.32 (m,5H),5.14 (s,2H),3.76～3.69 (m,1H),3.49～3.36 (m,1H),2.48～2.37 (m,1H),2.35～2.24 (m,1H),2.00～1.94 (m,1H),1.91～1.75 (m,6H),1.71～1.58 (m,3H),1.51～1.46 (m,2H),1.45～1.42 (m,2H),1.42～1.38 (m,4H),1.36～1.31 (m,2H),1.31～1.25 (m,2H),1.20～1.17 (m,1H),1.16～1.13 (m,1H),1.08～0.98 (m,1H),0.96～0.90 (m,10H),0.66 (s,3H). ESI-MS (m/z) 511.4 [M + H]+。

2.3 3α-三甲基硅氧-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（A-2）的分析数据

参照实验操作“1.2.2”，得到2.9 g白色固体A-2，产率76%，mp:72.3～75.9℃，1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ7.40～7.32 (m,5H),5.14 (s,2H),3.72 (s,1H),3.49～3.36 (m,1H),2.43 (ddd,J＝15.1,9.9,5.0 Hz,1H),2.35～2.24 (m,1H),2.00～1.94 (m,1H),1.91～1.75 (m,6H),1.65～1.63 (m,3H),1.48～1.47 (m,2H),1.45～1.42 (m,2H),1.39 (t,J＝5.9 Hz,4H),1.33 (d,J＝3.5 Hz,2H),1.31～1.25 (m,2H),1.18 (s,1H),1.15 (s,1H),1.04～1.01 (m,1H),0.93 (s 9H),0.66 (s,3H). ESI-MS (m/z) 583.2 [M + H]+。

2.4 3α-{3-[3α-羟基-7α-三甲基硅氧-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸苄基酯（A-4）的分析数据

参照实验操作“1.2.4”，得到1.4 g白色固体A-4，两步产率69%，mp:88.6～91.2℃，1H-NMR（400 MHz,CDCl3）δ7.40～7.33 (m,5H),5.14 (s,2H),4.64～4.50 (m,1H),3.71 (d,J＝12.0 Hz,2H),3.47～3.36 (m,1H),2.43 (ddd,J＝14.9,9.8,4.9 Hz,1H),2.33 (ddd,J＝12.8,9.4,5.6 Hz,2H),2.25～2.13 (m,1H),1.95 (ddd,J＝17.9,10.9,4.2 Hz,5H),1.85 (dd,J＝17.5,14.2 Hz,9H),1.63 (ddd,J＝17.0,10.8,9.3 Hz,8H),1.49～1.29 (m,21H),1.17 (dd,J＝21.0,11.6 Hz,8H),0.97～0.87 (m,20H),0.66 (d,J＝1.9 Hz,6H),0.13 (s,9H). ESI-MS (m/z) 985.8 [M + H]+。

2.5 3α-{3-[3α,7α-二羟基-6α-乙基-5β-孕甾烷-20-基]-丙酰氧基}-7α-羟基-6α-乙基-5β-胆烷酸（A-5）的分析 数据

参照实验操作1.2.5，得到97.3 mg A-5，产率65%，mp:193.9～196.5℃，1H-NMR (400 MHz,MeOD)δ4.59～4.44 (m,1H),3.70～3.66 (m,2H),3.39～3.29 (m,2H),2.43～2.28 (m,2H),2.29～2.15 (m,2H),2.13～1.97 (m,3H),1.96～1.73 (m,13H),1.71～1.62 (m,1H),1.63～1.44 (m,13H),1.42～1.26 (m,11H),1.26～1.08 (m,7H),1.07～1.01 (m,1H),1.00～0.95 (m,8H),0.95～0.89 (m,10H),0.72 (s,3H),0.71 (s,3H).13C-NMR (101 MHz,MeOD)δ176.77,174.38,78.18,77.86,77.53,75.08,71.82,69.88,69.67,55.99,55.93,50.28,45.52,45.35,42.42,42.39,41.74,41.67,40.16,40.13,39.64,39.63,35.45,35.39,35.34,35.30,35.24,35.02,33.21,33.13,33.02,31.38,31.01,30.97,30.67,29.90,29.29,27.95,26.51,23.25,23.22,22.57,22.42,22.13,22.08,20.65,17.60,17.57,11.10,11.03,10.80,10.78. ESI-MS (m/z) 821.5 [M - H]+。结果与参考文献一致[7]。

3 结论

本研究以奥贝胆酸为起始原料，经过上苄基酯化、TMS保护羟基、氢气钯碳体系脱苄基、酯缩合、脱保护等步骤合成得到了奥贝胆酸关键杂质二聚体A-5，总收率为30%。该杂质经1H-NMR、13C-NMR、MS等确证了其化学结构。同两分子奥贝胆酸直接反应相比，该方法具有产率高、纯化方便等优点。本研究合成出纯度较高的奥贝胆酸二聚体杂质，能够用于奥贝胆酸的质量分析和建立奥贝胆酸质量标准，具有较好的应用前景。