气相-顶空色谱法测定艾拉莫德中潜在基因毒杂质 氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷含量

徐 甲，尤 昆，尹春燕

（江苏正大清江制药有限公司，江苏 南京210033）

艾拉莫德在合成过程中使用了甲醇、乙醇、异丙醇和盐酸，有可能产生氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷这类潜在基因毒杂质。根据已有临床前研究发现这类杂质的DNA烷基化作用会导致诱变效应、致癌效应和致畸效应，参考ICH M7，按照TTC法计算。按照ICH规定连续服用10年，则该类杂质的人体摄入量每人每天不能超过10 μg/天，艾拉莫德最大日服用量为50 mg，计算可知，艾拉莫德原料药中的氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷限度不得超过200 ppm。

目前关于艾拉莫德含量和有关物质已有报道，但未见艾拉莫德中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的相关研究。在现有文献报道中，氯甲烷和氯乙烷的研究文献较多，2-氯丙烷研究的文献较少，未见氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷同时检出的研究报道。

本文建立了气相色谱检测本品中潜在基因毒杂质的方法，并进行了相应的方法学验证，该方法简便快速，可为艾拉莫德的质量优化提供参考依据。

1 实验

1.1 仪器与试药

Agilent 7890B气相色谱仪（带7697A顶空进样器）；梅特勒电子天平XS205R。

氯甲烷购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（批号：2RYZE-MO，纯度5.7%）；氯乙烷购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（批号：MZYGG-CE，纯度15%）；2-氯丙烷购自阿达玛斯试剂有限公司（批号：P12220-80，纯度99%）；二甲基亚砜购自Scharlau（GC级）；艾拉莫德原料由江苏正大清江制药有限公司提供。

1.2 色谱条件

以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱为色谱柱[如DB-624（30 m×0.32 mm×1.8 μm）或性能与之相当的色谱柱]；升温程序：初始50℃，维持2 min，以20℃/min升至180℃，维持5 min；进样口温度：200℃；分流比：10∶1；FID检测器；检测器温度：200℃；载气：高纯氮气；恒流模式：1.0 mL/min；顶空瓶平衡温度：80℃；顶空瓶平衡时间：30 min；进样体积：1 mL；外标法定量。

1.3 溶液制备

1.3.1 空白溶液

二甲基亚砜。

1.3.2 对照品储备液

分别取氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷各适量，精密称定，用DMSO溶解并稀释至刻度，作为储备液 （C＝0.4 mg/mL）。

1.3.3 对照品溶液

精密量取上述贮备液各5 mL，同置于100 mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。（C＝20 μg/mL）。

1.3.4 供试品溶液

取样品适量（约0.5 g），精密称定，置顶空瓶中，加5 mL DMSO，密封瓶口，加热使溶解，摇匀，作为供试品溶液。

1.3.5 供试品（加标）溶液

取样品适量（约0.5 g），精密称定，置顶空瓶中，加5 mL对照品溶液，密封瓶口，加热使溶解，摇匀，作为供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 溶剂和浓度的选择

氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷在甲醇、乙腈和DMSO中可溶，在水中几乎不溶，而艾拉莫德在DMSO中溶解度较好，故选择DMSO作为溶剂。按照ICH规定连续服用10年，则该类杂质的人体摄入量每人每天不能超过10 μg/天，艾拉莫德最大日服用量为50 mg，计算可知，艾拉莫德原料药中的氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷限度不得超过200 ppm。试验结果表明，当样品浓度为0.1 g/mL时，响应较好。

2.2 色谱条件的选择

根据氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的性质，本试验采用常用的中等极性分析柱DB-624色谱柱（固定相为6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷），最高使用温度可达300℃，具有极低的柱流失。通过不同流速（1.0、2.0、3.0 mL/min）考察，确定了流速为每分钟1.0 mL；通过对起始柱温（35、40、45℃）考察，确认了起始柱温为40℃，采用程序升温；考察了不同的顶空平衡温度及平衡时间，最终确定了色谱条件。试验结果表明各目标分析物的峰形尖锐，分离度较好。具体见图1。

图1 对照品溶液

2.3 专属性

分别按“1.3”配制专属性-空白溶剂（DMSO）、专属性-对照品溶液（20 μg/mL）、专属性-供试品溶液、专属性-供试品（加标）溶液。按“1.2”项下分析方法进行测定。结果显示溶剂DMSO和供试品溶液不影响氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷的检测；该方法专属性良好。

2.4 检测限及定量限

取“1.3.2”项下的对照品溶液逐级稀释，根据信噪比S/N＝3计算检出限；根据信噪比S/N＝10计算定量限；按“1.2”项下分析方法测定，测得氯甲烷的定量限浓度为2 μg/kg；氯乙烷的定量限浓度为2 μg/kg；2-氯丙烷的定量限浓度为2 μg/kg；氯甲烷的检出限为0.67 μg/kg；氯乙烷的检出限为0.5 μg/kg；2-氯丙烷的检出限为0.67 μg/kg；表明本方法的灵敏度较好。

2.5 线性试验

取“1.3.2”项下的氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷对照品储备液稀释制成每1 mL约含氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷5、10、16、20、24、30、40 μg的溶液，照上述“1.2”分析方法分别测定。以待测物浓度（μg/mL）为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，按最小二乘法进行线性回归。得到氯甲烷在5～39.97 μg/mL浓度范围内线性良好，y＝0.138 4x＋0.026 0；（r＝0.999 1，n＝7）；氯乙烷在5.04～40.33 μg/mL浓度范围内线性良好；y＝0.162 3x－0.000 3（r＝0.999 2，n＝7）；2-氯丙烷在5.11～40.88 μg/mL浓度范围内线性良好；y＝0.189 1x－0.028 3（r＝0.999 2，n＝7）；表明各溶剂在5～40 μg/mL浓度范围内具有良好的线性。

2.6 重复性试验

按“1.3”项下制备对照品溶液、供试品溶液和供试品（加标）溶液，供试品（加标）溶液制备6份。按“1.2”分析方法测定，结果6份供试品溶液中氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷回收率的RSD分别为1.8%、1.7%和1.9%，表明本测定方法的重复性良好。

2.7 准确度试验

按照“1.3.5”分别配制含各溶剂80%、100%、120%的供试品（加标）溶液，各配制3份。采用“1.2”分析方法测定。试验结果表明，各溶剂加标回收率均在85%～110%之间，方法的准确度良好，结果如表 1～3所示。

表1 回收率试验结果（氯甲烷）

表2 回收率试验结果（氯乙烷）

表3 回收率试验结果（2-氯丙烷）

2.8 样品测定

取三批艾拉莫德样品，按“1.3”项下制备对照品溶液和供试品溶液，按“1.2”项下分析方法测定。结果如表4所示，三批样品中氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷均未检出。

表4 氯甲烷、氯乙烷和2-氯丙烷测定结果

3 结论

本文以氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷为研究对象，建立了艾拉莫德样品中潜在基因毒杂质氯甲烷、氯乙烷、2-氯丙烷含量的气相分析方法。该方法具有专属性强，准确快速，灵敏度高等优点，符合定量分析要求。本方法可用于实验室和工业化生产质量控制分析。